摘要：NADP和NADPH在代谢和氧化还原反应中发挥着关键作用。NADP作为多种酶促反应的辅酶，尤其在光合作用和抗氧化应激防御中起重要作用。NADPH是NADP的还原形式，对生物合成反应（如脂肪酸和核苷酸合成）至关重要。此外，NADPH作为一种强还原剂，保护细胞免受

NADP和NADPH在代谢和氧化还原反应中发挥着关键作用。NADP作为多种酶促反应的辅酶，尤其在光合作用和抗氧化应激防御中起重要作用。NADPH是NADP的还原形式，对生物合成反应（如脂肪酸和核苷酸合成）至关重要。此外，NADPH作为一种强还原剂，保护细胞免受氧化损伤并维持氧化还原平衡。NADP和NADPH之间的动态相互作用对细胞功能和整体代谢平衡不可或缺。AkrivisBio的NADP/NADPH检测试剂盒是一种简单、灵敏的比色法检测方法，能够在多种生物样本中低至100皮摩尔水平定量检测NADP和/或NADPH。

艾美捷辅酶Ⅱ(NADP)-还原型辅酶Ⅱ(NADPH)测定试剂盒：

货号：MA-0126

规格：100孔

样本类型：细胞裂解液、组织裂解液

适用物种：所有

检测方法：比色法，吸光度450纳米

检测类型：定量检测

应用：一种基于微孔板的比色法检测方法，用于在多种生物样本中测量NADP和/或NADPH水平。

灵敏度：100皮摩尔

储存条件：-20°C

运输温度：冰凝胶包运输

保质期：自发货之日起一年

辅酶Ⅱ(NADP)-还原型辅酶Ⅱ(NADPH)测定试剂盒检测原理：

1.样本中存在的NADP被特异性的NADP依赖型乙醇脱氢酶转化为NADPH。

2.NADPH用于还原一种近乎无色的四氮唑盐，生成高度有色的甲臜。在此过程中，NADPH被重新转化为NADP。

3.通过在选定缓冲液中适当pH下孵育，可以选择性地破坏样本中的NADP，而不影响NADPH。

辅酶Ⅱ(NADP)-还原型辅酶Ⅱ(NADPH)测定试剂盒内容：

-提取缓冲液：50毫升（MA-0126A）

-循环缓冲液：15毫升（MA-0126B）

-乙醇脱氢酶：0.2毫升（绿色，MA-0126C）

-WST试剂：冻干粉（紫色，MA-0126D）

-终止液：1.2毫升（红色，MA-0126E）

-NADPH标准品：冻干粉（黄色，MA-0126F）

用户自备材料：

-PBS

-DMSO

-10kDa分子量截止离心过滤器

储存和处理：

-未开封的试剂盒应储存于-20°C。

-打开前将所有小瓶短暂离心数秒。

-使用前将试剂盒组分恢复至室温。

-提取缓冲液和循环缓冲液：即用型，储存于4°C。

-乙醇脱氢酶：使用时置于冰上。如果试剂盒将在几周内多次使用，可分装成小份量并储存于-20°C。

-WST试剂：用1.2毫升去离子水溶解。静置2分钟后轻轻振荡以溶解。储存于4°C。

-终止液：即用型，储存于4°C。

-NADPH标准品：用200微升DMSO溶解。储存于4°C。

检测步骤：

1.标准曲线：将NADPH标准品稀释至0.4微摩尔/升（将10微升标准品转移至含有990微升提取缓冲液的试管中，得到4皮摩尔/微升NADPH）。将稀释后的NADPH标准品0、5、10、15、20、25微升分别转移至96孔板的一系列孔中，双份进行，分别得到0、20、40、60、80和100皮摩尔/孔。用提取缓冲液将所有孔的体积调整至50微升。

注意：稀释后的NADPH溶液不稳定，必须在几小时内使用。细胞或组织裂解后的NADPH易因多种酶的存在而降解。通过以下方法可以更好地保存NADP/NADPH：将裂解样本通过10kDa分子量截止滤器过滤，或使用我们的样品脱蛋白试剂盒沉淀蛋白（确保最终溶液呈中性或碱性）。

2.样本准备：

-细胞：用冰冷的PBS洗涤细胞（4×10⁶个）或组织（50毫克）。以2000×g离心5分钟收集洗涤后的细胞。移除上清液，加入800微升提取缓冲液，混合后置于冰上10分钟。以16,000×g离心，将上清液转移至新的试管中。

-组织：用500微升提取缓冲液匀浆化，置于冰上10分钟。以16,000×g离心10分钟，将上清液转移至新的试管中。

-总NADP+NADPH检测：将50微升提取后的样本转移至96孔板的孔中，双份进行。

-仅检测NADPH：将200微升每个样本转移至微量离心管中，在60°C下加热30分钟以分解NADP。在此条件下，NADP被选择性分解。冷却至冰上。如有沉淀，短暂离心样本。将50微升每个样本转移至96孔板的孔中，双份进行。

3.启动反应：每个孔需要100微升反应混合液。根据要检测的孔数准备足够的反应混合液。

-循环缓冲液：98微升

-乙醇脱氢酶：2微升

混合均匀后，将100微升混合液加入每个孔中。让孔板静置5分钟，以将NADP转化为NADPH，然后再启动循环反应。

4.向每个孔中加入10微升WST试剂并混合。

5.测量：在室温下，以动力学模式在450纳米处监测反应，最长可达4小时。

注意：这是一个动力学检测，反应速率与NADPH的量成正比。如果需要，可以通过向每个孔中加入10微升终止液来停止反应。反应停止后，颜色在密封孔板中可稳定保持24-48小时。

6.典型结果：

7.计算：使用固定时间点的值或通过确定各个反应的斜率，从所有标准品和样本中减去0标准品的值。仔细检查动力学曲线，并选择仅包含吸光度随时间线性增加的时间范围。随着吸光度的增加，反应速率趋于下降，导致反应进程呈现向下曲线。将标准曲线绘制为吸光度或斜率与NADPH皮摩尔的关系。标准曲线的上端出现凸起，显示出轻微的非线性，不在直线上的点应被排除。将标准曲线的斜率应用于每个样本，即将样本值除以标准曲线的斜率。

来源：剧人之力