摘要：它处于一个关键节点，提供FADH₂，从而将电子引入细胞呼吸过程中的电子传递链。琥珀酸由乙酰辅酶A和草酰乙酸通过柠檬酸合酶生成，并在生成FADH₂的过程中转化为延胡索酸。琥珀酸还作为一种信号分子，参与多种细胞过程，包括炎症、缺氧反应和基因表达调控。在缺血等病理条

琥珀酸是三羧酸循环中的一个重要代谢产物。

它处于一个关键节点，提供FADH₂，从而将电子引入细胞呼吸过程中的电子传递链。琥珀酸由乙酰辅酶A和草酰乙酸通过柠檬酸合酶生成，并在生成FADH₂的过程中转化为延胡索酸。琥珀酸还作为一种信号分子，参与多种细胞过程，包括炎症、缺氧反应和基因表达调控。在缺血等病理条件下，琥珀酸会积累，损害线粒体功能，并促进氧化应激和组织损伤。AkrivisBio的琥珀酸检测法是一种简单、灵敏的定量检测方法，能够准确测定低于25微摩尔的琥珀酸。

艾美捷琥珀酸测定试剂盒：

货号：MA-0134

规格：100孔

检测方法：比色法，吸光度450纳米

检测类型：定量检测

应用：一种基于微孔板的比色法检测方法，用于在多种样本类型中定量检测低于25微摩尔的琥珀酸。

灵敏度：低于25微摩尔

储存条件：-20°C

运输温度：冰凝胶包运输

保质期：自发货之日起一年

琥珀酸测定试剂盒检测原理：

1.在ATP和辅酶A存在的情况下，琥珀酰辅酶A合成酶将琥珀酸转化为琥珀酰辅酶A，同时生成ADP。

2.己糖激酶利用ADP将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸。

3.葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化，将NAD转化为NADH。

4. NADH用于还原四氮唑，生成具有最大吸收波长为450纳米的高色素甲臜。

检测试剂：

-检测缓冲液：25毫升

-琥珀酰辅酶A合成酶：冻干粉，紫色试剂瓶

-己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶：冻干粉，绿色试剂瓶

- ATP/辅酶A/葡萄糖：冻干粉，蓝色试剂瓶

- WST-8试剂：冻干粉，红色试剂瓶

-琥珀酸标准品：冻干粉，黄色试剂瓶

储存和处理：

使用前储存于-20°C。使用前将检测缓冲液恢复至室温。打开前将所有小瓶短暂离心数秒。

-检测缓冲液：即用型，储存于-20°C。

-琥珀酰辅酶A合成酶、己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP/辅酶A/葡萄糖：用220微升检测缓冲液溶解。如果检测需要多次使用，可分装成小份量并储存于-20°C。使用时置于冰上。

- WST-8试剂：用220微升去离子水溶解。储存于-20°C。

-琥珀酸标准品：用100微升水溶解，得到40毫摩尔/升溶液。储存于-20°C。使用时置于冰上。

检测步骤：

1. 将微孔板读取器预热至37°C。

2. 标准曲线：将10微升标准品转移至990微升去离子水中，得到0.4毫摩尔/升溶液。将0、5、10、15、20、25微升的标准溶液分别转移至96孔板的一系列孔中，分别得到0、2、4、6、8、10纳摩尔琥珀酸。用琥珀酸检测缓冲液将所有孔的体积调整至50微升。

3. 样本准备：将组织（10毫克）或细胞（10⁶个）直接在100微升检测缓冲液中匀浆化。以16,000×g离心以去除颗粒物。将清亮的上清液转移至新的试管中。将每个样本的5-50微升转移至96孔板，并用检测缓冲液将所有孔的体积调整至50微升。

注意：

a. 该反应涉及辅酶A。涉及辅酶A的反应表现出辅酶A酯的非酶促水解，导致无效循环，从而产生较高的背景漂移。所有样本和标准品将以相同的速率漂移，从含有琥珀酸的样本中减去0标准和/或背景对照可以校正背景漂移。

b. 样本中的NADH会产生背景。将此类样本双份运行，使用配对孔作为背景对照。

c. 使用1%（重量/体积）聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）对有色样本（例如葡萄酒）进行脱色处理。孵育5分钟，然后通过10千道尔顿离心过滤器过滤。

4. 启动反应：根据要检测的样本和标准品数量准备足够的反应混合液。每个孔需要50微升反应混合液，包含以下成分：

- 反应混合液：检测缓冲液42微升，琥珀酰辅酶A合成酶2微升，己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶2微升，ATP/辅酶A/葡萄糖2微升，WST-8试剂2微升。

- 背景对照混合液：检测缓冲液44微升，己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶2微升，ATP/辅酶A/葡萄糖2微升，WST-8试剂2微升。

将50微升反应混合液加入含有标准品和样本的每个孔中，混合均匀。

5. 测量：在37°C下，用微孔板读取器在450纳米处监测反应30-60分钟，直到所有孔的吸光度平行漂移。

6. 典型结果

7. 计算：从所有标准品读数中减去0标准品读数。绘制标准曲线并确定标准曲线的斜率。该斜率定义了测量系统的吸光度/纳摩尔。如果运行了背景对照，则从配对样本中减去这些值，否则从0标准品的背景值中减去。将校正背景后的样本值除以标准曲线的斜率，以获得样本孔中琥珀酸的纳摩尔数。要将结果换算回每单位样本中的琥珀酸纳摩尔数：

- A. 将样本孔中的琥珀酸纳摩尔数除以加入孔中的样本微升数 = 样本中琥珀酸纳摩尔/微升。

- B. 将样本中琥珀酸纳摩尔/微升乘以离心步骤后新鲜试管中超氧化物歧化酶的总体积 = 样本中琥珀酸的总纳摩尔数。

- C. 将样本中琥珀酸的总纳摩尔数除以组织毫克数（或细胞数量等） = 每毫克组织（或细胞数量等）中的琥珀酸纳摩尔数。

来源：美少女科学家