摘要：冰晶的形成与生长是许多行业面临的共同挑战，涵盖建筑材料、交通运输、农业、食品和生物医药等多个领域。传统的防冻剂如乙二醇、甘油和二甲基亚砜（DMSO）虽有效但具有毒性，而多糖类虽能抑制冰晶再生长（IRI），却需要极高浓度，带来渗透压升高、粘度增加等问题。天然抗冻

新型防冻多肽问世：高效、经济、可生物降解的冰晶控制材料

冰晶的形成与生长是许多行业面临的共同挑战，涵盖建筑材料、交通运输、农业、食品和生物医药等多个领域。传统的防冻剂如乙二醇、甘油和二甲基亚砜（DMSO）虽有效但具有毒性，而多糖类虽能抑制冰晶再生长（IRI），却需要极高浓度，带来渗透压升高、粘度增加等问题。天然抗冻蛋白（AF(G)P）虽高效但提取困难、成本高昂，且易含过敏原，限制了其广泛应用。因此，开发一种高效、生物相容、经济且可规模化生产的仿生防冻材料迫在眉睫。

美国犹他大学Jessica R. Kramer团队报道了一种由丙氨酸（Ala）和谷氨酸（Glu）组成的全合成抗冻多肽，其在微克级浓度下即可有效抑制冰晶生长。该多肽采用经济高效的N-羧酸酐（NCA）聚合法制备，无需保护基即可在水中进行，具备良好的热稳定性、可生物降解性，且对细胞无毒。通过系统研究构象、电荷和疏水性等因素，团队揭示了其α-螺旋结构对防冻活性的关键作用，并证明其对镜像结构同样有效。概念验证实验表明，该多肽能保护模型蛋白药物在多次冻融循环中的活性，并可抑制冷冻食品中冰晶的生长，展现出在生物医药和食品工业中的广泛应用潜力。相关论文以“An Ultrapotent, Ultraeconomical, Antifreeze Polypeptide”为题，发表在

研究团队通过两种NCA聚合方法（A法需保护基与无水条件，B法则在开放水域中进行且无需保护基）成功合成了(Ala-Glu)共聚多肽。结构表征显示，该多肽呈典型的右手α-螺旋构象，其螺旋稳定性随链长增加而提高。圆二色谱（CD）分析进一步证实，镜像多肽(ADED)50形成左手螺旋，而外消旋多肽(AL/DEL/D)50则呈无序构象。热可逆性实验表明，(ALEL)50在95°C加热后仍能恢复原有构象，优于某些天然抗冻蛋白。

图1. 防冻聚合物面板的设计与合成 A) 面板的化学结构、卡通图示及性质。 B) 使用三光气将氨基酸转化为环状N-羧酸酐（NCA）单体；对于Glu和tBu-Glu NCA，添加环氧氯丙烷作为酸清除剂。NCA聚合采用方法A（需无水/惰性条件及保护基，可制备200+残基多肽）或方法B（可在开放大气和水相中进行，无需保护基，可通过功能胺调节链端基团，但多肽聚合度限制在≈50残基）。

图2. 多肽结构表征 A) tBu-EL NCA 与 (ALEL)50 的FTIR谱图对比。 B) 无保护基的EL NCA 与 (ALEL)50 的FTIR谱图对比。 C–E) 多肽在20°C PBS缓冲液中的CD光谱：C) (ALEL)n 的螺旋倾向与链长相关；D) (ALEL)50 和 (ALKL)50 形成与冬比目鱼AFP1类似的右手α-螺旋，而(VLEL)50 为无序结构；E) 镜像(ADED)50 为左手α-螺旋，外消旋(AL/DEL/D)50 为无序结构。 F) (ALEL)50 在4°C、95°C及再次冷却至4°C后的CD光谱，显示其构象热可逆性。

在抗冻活性方面，团队通过冰晶再生长抑制（IRI）实验发现，链长≥50残基的(ALEL)n在100 μg/mL浓度下即可抑制91–94%的冰晶生长，效果优于100 mg/mL的DMSO。构象有序性被证明是关键因素：无序的外消旋多肽即使浓度提高10倍仍无活性，而带电性质（阴离子Glu vs 阳离子Lys）对活性影响不显著。动态冰形貌实验显示，(ALEL)50可诱导冰晶形成六边形板状结构，表明其可能结合于冰的棱柱面。此外，缓冲液离子组成对阳离子多肽的冰形貌调控能力有影响，而阴离子(ALEL)50在不同缓冲体系中均保持稳定活性。

图3. 防冻活性测定 A–E) IRI splat assay 代表性图像（冰晶生长40分钟后）：A) PBS阴性对照；B) wfAFP1阳性对照（100 μg/mL）；C) (ALEL)50（100 μg/mL）；D) (VLEL)50（1 mg/mL）；E) (AD/LED/L)50（1 mg/mL）。比例尺为200 μm。 F–H) IRI定量数据（相对于PBS的冰晶平均粒径百分比）：F) (ALEL)50、G) (ALEL)200 在不同浓度下的活性；H) 多种多肽与对照的并列比较。 I) 动态冰形貌实验：PBS对照 vs (ALEL)50（100 μg/mL）。 J–M) 阴离子(ALEL)50 与阳离子(ALKL)50 在阴离子PBS vs 阳离子TBS缓冲液中的冰形貌比较（500 μg/mL）。比例尺为100 μm。

生物相容性与降解性实验表明，阴离子(ALEL)75即使在高浓度下也对HEK 293细胞无毒，而阳离子(ALKL)75则表现出浓度依赖性毒性。蛋白酶降解实验证实，L型多肽可被蛋白酶K和胃蛋白酶完全降解，而D型镜像多肽则能抵抗酶解，为其在不同寿命要求的应用中提供了选择。

在概念验证应用中，(ALEL)50能显著保护乳酸脱氢酶（LDH）在8次冻融循环后的活性，100 μg/mL即可实现完全保护。对于抗增强绿色荧光蛋白抗体（aEGFP），该多肽也能有效防止冻融引起的功能损失。然而，对于曲妥珠单抗（trastuzumab），其本身具有良好的冻融稳定性，多肽的保护效果不明显。在食品应用方面，添加(ALEL)50的冰淇淋在冷冻后冰晶尺寸显著减小，显示出其在改善冷冻食品质构方面的潜力。

图4. 细胞相容性、生物降解性及冻融保护应用 A) HEK 293细胞存活率（CCK8法）：阴离子(ALEL)75 与阳离子(ALKL)75 在不同浓度下的毒性对比。 B) SEC/MALS谱图：(ALEL)50 在蛋白酶K处理前后的生物降解性。 C) LDH在8次冻融循环后的酶活性（添加不同浓度(ALEL)50）。 D) aEGFP抗体在0/1/20次冻融后的结合活性变化。 E) 曲妥珠单抗在0/1/20次冻融后的结合活性变化。 F) 冰淇淋中添加100 μg/mL (ALEL)50 的IRI活性定量（相对于未处理对照）。 G) 未添加多肽的冷冻乳制品冰晶图像。 H) 添加(ALEL)50 的样品冰晶图像。

综上所述，该研究开发了一种基于天然氨基酸的高效、经济、可生物降解的防冻多肽，其具备优异的冰晶控制能力、良好的生物相容性和可调的降解性能，在生物医药、食品工业、农业和涂层材料等领域具有广阔的应用前景。未来，这种仿生多肽有望替代传统有毒防冻剂，为低温存储和冷冻保护提供可持续的解决方案。

声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！

来源：佳佳聊科学