小鼠结肠炎类器官诱导攻略

摘要：CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅（abs72023）或水浴摇床，医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

小鼠结肠炎类器官诱导分为两步：结肠类器官的构建及结肠炎类器官的诱导。

结肠类器官的构建

一、准备工作

1、仪器设备

CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅（abs72023）或水浴摇床，医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2、试剂耗材

小鼠正常结肠类器官培养基试剂盒（abs9985）、基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）、60mm细胞培养皿（abs7005）、 100μm滤筛（abs7009）、15ml离心管（abs7102）、1.5ml EP管若干（abs7119）、24孔细胞培养板（abs7035）、金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊。

二、操作流程

1、样本准备

（1）将组织放入含有预冷的（2-8°C）组织保存液 E的取样瓶中（浸没整个组织），4℃从医院/实验室取回。

（2）将取样瓶消毒，组织取出放入培养皿样本拍照，并登记，大小，颜色，软硬程度，组织类型等信息。

2、清洗-剪碎

（1）在60mm细胞培养皿（abs7005）里用2-3ml原代培养缓冲液 B浸泡。用原代培养缓冲液 B清洗三次（每次更换培养皿）后剪碎，剪成大约1-3mm3的组织块，转移至15ml离心管。

3、消化-过滤

（2）向15ml离心管中加入5倍原代组织消化液 C（消化液体积：组织体积=5:1，如果估量组织体积困难，使用5mL消化液通常足够）在4℃进行消化15-30min（消化过程中随时观察消化情况）。

（3）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的细胞团（5-50个细胞抱团）后，加入3倍体积原代培养缓冲液 B（缓冲液体积：消化液体积=3:1）终止消化，用枪头轻柔吹打可以看到液体变浑浊。

（4）使用100μm滤筛（abs7009）进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到15ml离心管，于300g 4℃ 富集离心5min后移去上清。

4、加胶-点板-加液（这里是整个原代操作的点睛之笔）

（1）准备工作

a 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化

b 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时

c 融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完

（2）接种要求

24孔板（abs7035），每孔25ul基质胶细胞团混合物，500-750uL类器官培养液

（3）接种密度

密度建议2：500个细胞团/25uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）

（4）加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶（abs9495），进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性。

（5）加液

将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶，添加500-750μl类器官培养基 A进行培养。大概10-14天，多数类器官直径在200um-500um，可进行传代操作。

铺板密度

结肠炎类器官的诱导

一、准备工作

小鼠正常结肠类器官培养基（abs9984）、基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）、DSS（abs9192）、Mouse IL-6 ELISA Kit（abs520004-96T）、Mouse TNF-α ELISA Kit(Advanced)（abs520032-96T）、 60mm细胞培养皿（abs7005）、100μm滤筛（abs7009）、15ml离心管（abs7102）、1.5ml EP管若干（abs7119）、24孔细胞培养板（abs7035）、金属冰盒（abs7289）。

二、结肠炎类器官诱导方法

传代后的类器官，在day2-3，类器官雏形出现（囊泡出现），用含有20μg/mL DSS的类器官培养基连续处理120h，期间每2天换一次DSS的类器官培养基。

三、结肠炎类器官验证

1、明场验证

每天记录Control（非炎症诱导组）和Modle（炎症诱导组）的类器官明场照片。