摘要：羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一种非必需亚氨基酸，主要存在于动物的胶原蛋白和弹性蛋白中。在植物细胞壁中，富含羟脯氨酸的蛋白质被用作糖链的附着点。羟脯氨酸在胶原蛋白中通过增强其机械稳定性发挥功能。在疾病状态下（如肝纤维化、佩吉特病、骨转移等）
羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一种非必需亚氨基酸，主要存在于动物的胶原蛋白和弹性蛋白中。在植物细胞壁中，富含羟脯氨酸的蛋白质被用作糖链的附着点。羟脯氨酸在胶原蛋白中通过增强其机械稳定性发挥功能。在疾病状态下（如肝纤维化、佩吉特病、骨转移等），通过测量水解产物或血清和尿液中的羟脯氨酸水平，可以评估胶原蛋白的形成和代谢。
AkrivisBio的羟脯氨酸检测试剂盒主要用于检测蛋白质和组织水解产物中的羟脯氨酸。血清和尿液经过适当预处理后也可作为检测样本。该试剂盒提供了一种简单的羟脯氨酸测量方法，生成的显色剂可在550-565纳米波长范围内测量，适用于1-20微克胶原蛋白或约0.1-2微克羟脯氨酸的检测。
艾美捷羟脯氨酸测定试剂盒#MA-0101检测原理：
1.样本在酸中彻底水解。
2.羟脯氨酸被氯胺T氧化为吡咯。
3.吡咯随后与艾氏试剂（Ehrlich’sReagent）反应生成显色物质。
检测试剂：
-氧化缓冲液：10毫升
-氯胺T浓缩液：0.6毫升
-酸/异丙醇溶液：5毫升
-DMAB浓缩液：5毫升
-羟脯氨酸标准品（1毫克/毫升）：0.1毫升
-微孔板封口膜：1张
用户自备试剂和设备：
-12摩尔/升盐酸
-96孔透明平底板
-烤箱或热板
-聚丙烯试管
储存和处理：
将试剂盒储存于+4°C。使用前短暂离心小瓶。阅读完整协议后再进行检测。
-氯胺T试剂：每孔加入6微升氯胺T浓缩液至94微升氧化缓冲液中，混合均匀。
-DMAB试剂：每孔加入50微升DMAB浓缩液至50微升酸/异丙醇溶液中，混合均匀。
-注意：为获得最佳结果，建议在2-3小时内使用稀释后的试剂。
检测步骤：
1.样本准备：将样本用100微升去离子水/10毫克组织匀浆化。在耐压试管（如Nalgene微型试管）中加入等体积浓盐酸（约12N，未提供），混合均匀后在120°C下水解3小时。尿液样本也用等体积浓盐酸处理并同样水解。之后，尿液样本需用活性炭（1毫克/50微升尿液/盐酸混合物）处理，离心3分钟以去除活性炭。将每个水解后的样本10微升转移到96孔板中，并在热源和/或真空中蒸发至干燥。
-注意：内源性化合物可能干扰反应。为确保准确测定样本中的羟脯氨酸，建议向样本中加入已知量的标准品（0.4微克）。
2.标准曲线：将羟脯氨酸标准品稀释至40微克/毫升，方法是将10微升1毫克/毫升的标准品加入240微升去离子水中，混合均匀。将0、5、10、15、20、25微升分别加入一系列孔中，每种浓度双孔。这将得到一个0-0.2-0.4-0.6-0.8-1微克/孔的标准曲线。
3.氧化反应：向每个样本和标准品孔中加入100微升氯胺T试剂，室温下氧化反应5分钟。
4.显色反应：向每个孔中加入100微升DMAB试剂，盖上孔板封口膜，在60°C下反应30-40分钟，使颜色完全显色。
-注意：氯胺T试剂和DMAB试剂密度差异大，不易混合。封板前，每个孔上下吸打2-3次以混合均匀。显色反应在约30分钟时达到最大值。如果反应时间过长，颜色会褪去。颜色在室温下可保持稳定。
5.测量：在560纳米处测量吸光度。
6.计算：从所有读数中减去0微克羟脯氨酸标准品的吸光度值。绘制标准曲线。曲线的斜率定义了系统的灵敏度。将背景校正后的样本读数除以标准曲线的斜率，以确定测试孔中的羟脯氨酸量。通过以下步骤推算回原始样本中的量：
-A.将孔中的羟脯氨酸量除以加入孔中的样本体积（微升）=样本中羟脯氨酸/样本微升
-B.将样本中羟脯氨酸/样本微升乘以1中样本的总体积=样本中总羟脯氨酸
-C.将样本中总羟脯氨酸乘以处理过程中产生的任何稀释因子。
-D.将样本中总羟脯氨酸除以处理前的组织毫克数或液体样本体积=样本中羟脯氨酸/组织毫克等。
-注意：许多代谢物和其他化学物质可能会显著干扰各种反应化学。为了更精确的测定，在没有样本和有恒定量样本的情况下进行标准曲线。没有必要运行所有六个标准；使用最少的3个（0-10-20微升）来验证吸光度响应是否与分析物量呈线性关系。两个标准曲线的斜率应该相同。它们之间的吸光度偏差归因于样本中的分析物量（当前情况下的羟脯氨酸）。如果两个斜率不同，则存在矩阵效应影响反应化学。在这种情况下，确定0标准之间的吸光度差异，并将其应用于在样本存在的情况下运行的标准曲线的斜率。
具有大矩阵效应的样品示例（右图）：
0标准之间的差异为0.35。在样本存在的情况下，斜率为0.226吸光度/微克。具有基质效应的样本中羟脯氨酸的量为0.35吸光度/0.226吸光度/微克 = 1.55微克。
来源：美少女科学家