Nature | 可编程反义寡核苷酸：开启噬菌体功能基因组学的新工具

摘要：噬菌体与其宿主的相互作用涉及大量未知基因，这些基因的功能尚有待深入探索。然而，噬菌体及其宿主的高度多样性，以及遗传操作的技术限制，使得研究这些未知基因面临诸多挑战【1】。尽管已有small RNAs和CRISPR-Cas等工具被用于噬菌体基因功能研究，但宿主防

撰文 | 染色体

噬菌体与其宿主的相互作用涉及大量未知基因，这些基因的功能尚有待深入探索。然而，噬菌体及其宿主的高度多样性，以及遗传操作的技术限制，使得研究这些未知基因面临诸多挑战【1】。尽管已有small RNAs和CRISPR-Cas等工具被用于噬菌体基因功能研究，但宿主防御系统及噬菌体对Cas酶的抵抗，仍在很大程度上限制了这些技术的有效应用【2】。

近日，来自德国亥姆霍兹感染研究中心的Jörg Vogel团队在Nature期刊发表题为Programmable antisense oligomers for phage functional genomics（研究噬菌体功能基因组学的可编程反义寡核苷酸）的文章。研究人员提出了一种基于可编程反义寡核苷酸（ASOs）的非遗传沉默方法，可在DNA和RNA噬菌体中特异性靶向关键基因。以巨型噬菌体ΦKZ为例，研究发现了多种对噬菌体增殖至关重要的蛋白质，并展示了该方法在噬菌体功能研究、抗感染治疗以及生物技术应用中的潜力。

ΦKZ类噬菌体因其潜在的治疗价值和复杂的感染周期而受到广泛关注。其感染过程包括基因组注入、噬菌体细胞核的形成，以及基因组复制与装配。研究表明，多种保守蛋白参与噬菌体细胞核的构建与定位，但仍有大量编码蛋白的基因功能未被阐明。此外，噬菌体细胞核还可屏蔽CRISPR-Cas系统和限制性核酸酶的作用，使得对这些基因的靶向操作更具挑战性【3】。

ASO介导的噬菌体基因沉默验证与应用

研究发现，铜绿假单胞菌可以通过ASO实现高效基因沉默。由于ΦKZ噬菌体mRNA依赖宿主核糖体进行翻译，研究团队设计了针对关键基因chmA的11碱基ASO，并通过细胞穿透肽递送至细菌胞质。实验结果显示，在感染20分钟后，chmA蛋白合成完全被抑制。功能验证进一步显示，chmA是噬菌体必需基因，其沉默会阻断噬菌体细胞核形成，停止复制周期，并完全消除噬斑生成。这一结果与以往CRISPR-Cas抑制chmA的研究结果一致。通过系统优化，研究团队确定了最佳实验条件：11碱基ASO、(RXR)₄XB载体、6 µM浓度以及感染前30分钟预处理。在这一条件下，低MOI感染即可观察到明显的噬斑减少和宿主裂解。进一步实验还显示，ASO可以靶向非必需基因phuZ，其沉默会导致噬菌体细胞核定位缺失，模拟基因缺失突变的表型，验证了ASO在噬菌体基因功能研究中的有效性。

噬菌体功能基因解析与感染周期机制研究

接下来，在系统探索ΦKZ关键基因功能的研究中，ASO显示了在特异性设计、多样化应用及大规模筛选方面的巨大潜力。通过MASON算法优化设计的ASO具备适宜的Tm值、低自互补性等特点。实验表明，靶向chmA mRNA的多个ASO均能有效抑制噬菌体复制，并在多顺反子转录本中实现高选择性，仅抑制目标蛋白的合成，而不影响宿主或其他噬菌体蛋白的表达。ASO克服了遗传操作受限的问题，即使在临床分离株中，也能阻断噬菌体核形成。同时，ASO可靶向宿主防御基因如jukAB，使原本抗噬菌体的菌株重新变得易感；在噬菌体基因ΦKZ014沉默实验中，ASO模拟了基因缺失突变的效应，揭示了宿主-噬菌体的防御与反防御机制。该方法适用于不同宿主、革兰氏阴性或阳性细菌，以及DNA或RNA噬菌体。在对ΦKZ核心基因进行大规模筛选时，研究发现约三分之一的基因沉默显著影响噬菌体增殖，包括已知的chmA、nvRNAP和PicA，以及若干未知功能的基因如ΦKZ049。部分基因沉默虽仅轻度降低噬斑形成，但仍能保护宿主免于裂解，提示其在竞争环境中的重要性。结合RNA-seq分析，ASO沉默chmA会阻断噬菌体核形成，导致中晚期基因转录缺失，而早期基因转录延长，同时揭示了不同基因沉默下噬菌体及宿主的特异性转录反应，并预测了潜在功能基因簇。进一步研究显示，ΦKZ155在噬菌体感染周期中具有关键作用。ASO沉默ΦKZ155会阻止噬菌体核的成熟和基因组扩增，使感染周期停滞于噬菌体核初步形成后的关键节点。互补实验表明，其功能不依赖于RNase H活性，提示ΦKZ155可能承担结构或调控作用；其同源基因如ΦPA3的gp176也具有类似功能。这一发现表明，通过ASO介导的靶向沉默，可人为创建感染周期的“停滞状态”，为解析关键调控节点及噬菌体-宿主互作机制提供了新方法。

综上所述，该研究提出一种无需遗传操作的方法，通过细胞穿透肽递送合成ASOs进入细菌胞质，以阻断噬菌体mRNA翻译，从而评估基因功能，研究ΦKZ感染过程。研究表明，更多ΦKZ蛋白参与复制周期的调控，其中保守蛋白ΦKZ155在基因组扩增前的关键节点发挥重要作用，为进一步解析噬菌体功能基因和感染机制提供了强有力的工具与策略。

制版人：十一

参考文献

[1] Bernheim, A. & Sorek, R. The pan-immune system of bacteria: antiviral defence as a community resource.Nat. Rev. Microbiol.18, 113-119 (2020).

[2] Bondy-Denomy, J., Pawluk, A., Maxwell, K. L. & Davidson, A. R. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system.Nature493, 429-432 (2013).

[3] Mendoza, S. D. et al. A bacteriophage nucleus-like compartment shields DNA from CRISPR nucleases.Nature577, 244-248 (2020).

学术合作组织

（*排名不分先后）