【客户文献分享】| 一种新型 ceRNA 轴 LOC121818100/ miR-400/SSRP1轴调控绵羊肌肉生长与损伤修复

摘要：绵羊是我国重要的肉用畜种，其肌肉生长速度与效率直接影响经济效益。尽管已知ceRNA机制在小鼠、鸡等物种肌肉发育中发挥作用，但在绵羊中相关研究仍较为缺乏。本研究以肌肉生长速度快的小尾寒羊（STH）和生长速度慢的苏尼特羊（SNT）为模型，通过转录组测序构建ceRN

绵羊是我国重要的肉用畜种，其肌肉生长速度与效率直接影响经济效益。尽管已知ceRNA机制在小鼠、鸡等物种肌肉发育中发挥作用，但在绵羊中相关研究仍较为缺乏。本研究以肌肉生长速度快的小尾寒羊（STH）和生长速度慢的苏尼特羊（SNT）为模型，通过转录组测序构建ceRNA网络，旨在筛选并验证关键ceRNA轴，揭示其调控肌肉发育的分子机制。骨骼肌是哺乳动物体内最大的组织之一，其生长发育直接影响肉类产量与品质，也与多种肌肉疾病（如肌萎缩、肌肥大等）密切相关。近年来，非编码RNA（ncRNA）在肌肉发育调控中的作用日益受到关注，尤其是长链非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源RNA（ceRNA）通过“吸附”微RNA（miRNA）间接调控靶基因表达的机制，已成为解析复杂性状遗传基础的重要途径。然而，在绵羊这一重要农业动物中，ceRNA网络调控肌肉发育的具体机制仍不清楚。

2025年6月5日，国农业科学院动物科学研究所团队在《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》上发表题为"A Novel ceRNA Axis LOC121818100/Novel-miR-400/SSRP1 Regulated Muscle Growth and Injury Repair in Sheep" 的研究论文。该研究通过多组学整合与功能验证，首次揭示了LOC121818100/Novel-miR-400/SSRP1这一ceRNA轴在绵羊骨骼肌生长与损伤修复中的关键作用。

研究思路

ceRNA网络构建与关键轴筛选

对STH与SNT羊背最长肌进行RNA-seq, 通过火山图和热图直观展示STH与SNT羊肌肉组织中差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA，为后续网络构建提供了数据基础（图1A-B）。

通过生物信息学预测构建了包含146个关系的ceRNA网络。图中红框标出的 LOC121818100/Novel-miR-400/SSRP1 通路，因其与肌肉发育功能关联最强而被选定为后续研究对象。此图体现了从海量数据中精准筛选候选靶标的过程（图1C）。

图1. 基于DE lncRNA、miRNA和mRNA构建ceRNA网络

关键基因功能验证

为了证实RNA-seq数据的有效性，我们检查了LOC121818100、Novel-miR-400和SSRP1在STH和SNT背最长肌组织中的表达水平。结果表明，LOC121818100（图2A）和SSRP1基因（图2C，D）的mRNA水平在快速生长的STH中高于SNT。STH中新型miR-400表达水平降低（图2B），与LOC121818100和SSRP1的表达形成鲜明对比（图2E）。IHC检测结果显示，SSRP1广泛分布于绵羊肌肉组织中，在STH中的表达高于SNT（图2F）。这些结果与RNA-seq一致，证明了测序数据的可靠性和构建的ceRNA网络的可行性。

图2. LOC121818100/Novel-miR-400/SSRP1在STH和SNT肌组织中的表达水平

SSRP1的功能验证（体外与体内）

体外

在绵羊成肌细胞中，过表达SSRP1能显著上调增殖标志物（PCNA, CCND1等）的mRNA和蛋白水平，敲低则相反。直接证明了SSRP1对成肌细胞增殖的促进作用（图3A-B）。

CCK-8、EdU和细胞周期实验共同表明，SSRP1能显著促进细胞增殖活力并推动细胞进入S期。从多个角度提供了功能学证据(图3C-E)。

图3. LOC121818100/Novel-miR-400/SSRP1在STH和SNT肌组织中的表达水平

体内

为了进一步验证SSRP1在骨骼肌发育中的功能，我们进行了同源性分析。SSRP1基因在绵羊和小鼠之间的同源性达到95%（图S7）。因此，我们使用小鼠模型进一步研究了SSRP1在体内骨骼肌发育中的参与。我们建立了肌肉损伤的小鼠模型。HE染色结果显示，CTX处理后，小鼠TA肌的肌纤维溶解在许多分散的细胞核中（图4A）。在CTX处理后1-4天观察到SSRP1表达的显着变化（图4B）。在CTX处理后第1/2、2和4天，转染SSRP1质粒，实现SSRP1过表达。或者，在CTX处理后的第1天和第2天注射siRNA以降低SSRP1表达（图4C）。这些分别导致第 4 天的 SSRP1 和 PCNA mRNA 水平升高或第 3 天的水平降低（图 4D）。HE染色表明，与对照组相比，SSRP1的过表达加速了肌肉修复的速度（图4E）。抑制SSRP1表达显示出相反的效果（图4E）。综上所述，这些结果表明SSRP1可以促进肌肉再生，进一步证实了SSRP1参与骨骼肌发育。

图4. SSRP1的过表达促进体内骨骼肌再生

机制剖析

双荧光素酶报告基因实验显示，Novel-miR-400 mimics能显著抑制携带SSRP1野生型3‘UTR（SSRP1-WT）的荧光素酶活性，但对突变型（SSRP1-MUT）无影响，直接证实了Novel-miR-400与SSRP1的直接靶向关系。功能挽救实验表明，SSRP1的过表达可以逆转由Novel-miR-400 mimics引起的增殖抑制。确立了“Novel-miR-400 → SSRP1”这一核心调控轴线。

许多研究表明，当lncRNA位于细胞质中时，它主要通过与miRNA相互作用来发挥作用，使用FISH和亚细胞定位实验证实LOC121818100主要定位于细胞质，这是其能够作为miRNA海绵发挥作用的重要前提。双荧光素酶报告基因实验证实LOC121818100与Novel-miR-400存在直接结合（图5C）。RIP实验是另一项关键证据，琼脂糖凝胶电泳和RT-qPCR的结果表明，与起始对照相比，抗Ago2可以有效降低LOC121818100和Novel-miR-400的表达。此外，与NC相比，用Novel-miR-400模拟物转染的细胞显示出高富集的LOC121818100和Novel-miR-400（图5D&E）。RNA Pull-down实验使用生物素标记的Novel-miR-400，也能拉下LOC121818100，与RIP实验相互印证，形成了完整的证据链（图5F）。

图5. LOC121818100作为Novel-miR-400的miRNA海绵来调节SSRP1的表达

通过实验最终证实ceRNA机制的核心。实验表明，敲低LOC121818100对SSRP1的抑制效应，可被共转Novel-miR-400抑制剂所逆转；反之，过表达LOC121818100的促进作用也可被Novel-miR-400 mimics抵消（图6A-E）。研究的总结性模型图（图6F），清晰地描绘了完整的调控通路：LOC121818100在细胞质中吸附Novel-miR-400，解除其对SSRP1 mRNA的抑制作用，从而促进SSRP1表达，最终驱动成肌细胞增殖和骨骼肌发育。