摘要：Jun N末端激酶（JNK）信号通路通过调节程序性细胞死亡在昆虫变态过程中的组织重塑中起关键作用。然而，鳞翅目昆虫中JNK通路的多个成员仍未得到充分研究。本研究从鳞翅目模式昆虫家蚕（Bombyx mori）中克隆了JNK通路的两个关键基因BmJun和BmFos
研究概述
Jun N末端激酶（JNK）信号通路通过调节程序性细胞死亡在昆虫变态过程中的组织重塑中起关键作用。然而，鳞翅目昆虫中JNK通路的多个成员仍未得到充分研究。本研究从鳞翅目模式昆虫家蚕（Bombyx mori）中克隆了JNK通路的两个关键基因BmJun和BmFos，并研究了它们对生殖发育的影响。BmJun和BmFos分别编码239和380个氨基酸。这两种蛋白质都具有典型的碱性亮氨酸拉链结构域，并形成BmJUN-BmFOS二聚体激活蛋白以发挥转录调控作用。在家蚕发育的游走期，干扰BmJun的表达对化蛹没有影响，但对卵发育至关重要的家蚕卵黄原蛋白（BmVg）在脂肪体中的表达受到抑制，产卵量显著减少。此外，许多卵出现皱缩和变形，表明其营养发育不良。抑制JNK通路导致蛹变态异常、皱缩未受精卵增加、脂肪体合成减少以及BmVg在家蚕雌性卵巢中的积累。结果表明，BmJUN和BmFOS可以形成AP-1二聚体。干扰BmJun或抑制BmJUN的磷酸化会导致脂肪体中BmVg的合成减少及其在卵巢中的积累，从而影响后代卵的质量和产量。这些发现表明，调节JNK通路中的Jun可能是抑制鳞翅目雌性繁殖的潜在途径。
JNK通路对家蚕卵发育影响的示意图。BmJNK被磷酸化激活后进入细胞核并磷酸化BmJUN。磷酸化的BmJUN与BmFOS形成AP-1二聚体，也称为激活蛋白1（AP-1）。干扰BmJun或抑制BmJUN的磷酸化会导致BmVg转录的下调，从而影响后代卵的质量和产量。
主要研究结果
BmJun的克隆与定位
BmJun的克隆和生物信息学分析。（a）BmJUN与DJUN的同源性比对。红线表示果蝇DJUN蛋白的bZIP结构域。（b）BmJun的PCR产物。（c）BmJun基因3'末端的扩增产物。（d）BmJun基因的5' RACE扩增产物。P1是非特异性扩增条带，P2是目标片段。（e）BmJUN蛋白的分子量。使用果蝇DJUN抗体进行检测。M，Marker。
BmJun的时空表达与定位。（a）游走期组织中BmJun的表达。EPI，表皮；MG，中肠；MT，马氏管；FB，脂肪体；TE，精巢；OV，卵巢；HE，血淋巴；SG，丝腺；TR，气管。（b）不同发育阶段脂肪体中BmJun的表达。FB-W、FB-PP和FB-P1分别表示游走期、预蛹期重塑期和1日龄蛹期的脂肪体形态，脂肪体形态的变化详见图S3。（c）脂肪体和卵巢中的BmJUN蛋白。5L7d，5龄7日龄幼虫；W，游走期；S，吐丝期；PP，预蛹期；P1至P5，1日龄至5日龄蛹。（d）BmJUN蛋白在BmN细胞中的亚细胞定位。
BmJun参与调控卵的质量和产量
RNAi干扰BmJun表达对后代卵质量和产量的影响。（a–f），每只家蚕在游走期注射6 μg BmJun基因的siRNA。NC，阴性对照；RNAi，RNA干扰。（a & f），注射siRNA 48小时后，每组取3只家蚕，通过qRT-PCR检测脂肪体中基因的mRNA水平，以BmRp49或18S rRNA基因为参照。**p
家蚕中BmJUN与BmFOS蛋白的相互作用。（a）BmFos基因在家蚕变态过程中脂肪体中的表达谱。5L7d，5龄7日龄幼虫；W，游走期；S，吐丝期；PP，预蛹期；P1至P5。（b）Co-IP检测BmJUN与BmFOS的相互作用。将过表达质粒pCMV-BmJun-EGFP和pCMV-BmFos-Flag转染至人HEK 293T细胞系进行表达。
JNK抑制对家蚕卵巢和卵发育的影响。每只雌性家蚕在游走期注射10 μL SP600125的DMSO溶液，剂量为10 μg或50 μg，对照组（CK）注射10 μL DMSO。羽化后，成虫与未处理的雄蛾交配。（a）性腺指数的变化（n = 4）。S，吐丝期；PP，预蛹期；P1，1日龄蛹；P4，4日龄蛹；P7，7日龄蛹；M1，1日龄成虫（蛾）。（b）雌性家蚕产卵后残余卵状态的卵巢分类（n = 12）。C，完全产卵；H，半产卵；L，少量产卵；D，死亡。OT，卵巢管。（c）雌蛾的产卵量（n = 4）。（d）单只蛾产卵中正常受精卵的数量。（e）单只蛾产卵中异常卵的数量（n = 3–5）。（f）未受精卵的发生率。调查在产卵后7天进行。FE，受精卵。卵的深褐色是受精后形成的具有滞育特性的浆膜细胞色素，伴随着卵裂和胚胎发育。UE，未受精卵。卵的颜色保持与受精前相同的淡黄色。（g）注射10 μg SP600125的雌性家蚕产卵1天时的皱缩卵。NE，新产的正常卵。SE，皱缩卵。（h）脂肪体和卵巢中BmVg表达的Western blotting。Tubulin蛋白作为内参。
BmJUN和BmFOS可以形成AP-1二聚体。干扰BmJun或抑制BmJUN的磷酸化会导致脂肪体中BmVg的合成减少及其在卵巢中的积累，从而影响后代卵的质量和产量。
来源：亮养半生一点号1