摘要：研究活细胞内细胞器相互作用组时，需同时观察多种亚细胞结构及其动态变化，但传统技术存在诸多局限：多色荧光标记依赖特异性荧光标记，可分辨的颜色数量远少于细胞器类型，且因荧光光谱重叠、多激发 / 检测步骤导致成像速度下降，还面临标记繁琐、效率低（尤其在活组织中）及光

研究活细胞内细胞器相互作用组时，需同时观察多种亚细胞结构及其动态变化，但传统技术存在诸多局限：多色荧光标记依赖特异性荧光标记，可分辨的颜色数量远少于细胞器类型，且因荧光光谱重叠、多激发 / 检测步骤导致成像速度下降，还面临标记繁琐、效率低（尤其在活组织中）及光毒性等问题；光学显微镜虽能用于活细胞成像，却受限于细胞器尺寸常小于衍射极限、动态相互作用快易产生运动伪影、种类多需同时监测等挑战；超分辨率荧光显微镜虽提升了空间分辨率，却往往以牺牲时间分辨率为代价，且最多仅能实现三种颜色成像；深度学习虽被尝试用于从明场图像预测荧光图像，但现有训练图像分辨率和对比度低，难以准确呈现亚细胞结构，且 3D 成像耗时，无法捕捉细胞器的快速动态。这些问题共同推动了新的成像方法的研发，以实现对活细胞内多种细胞器的高效、高分辨率动态观测。

研究人员开发了一种结合脂质特异性染料 Nile Red、旋转盘显微镜与深度卷积神经网络（DCNN）的方法，通过 “一对多” 策略染色所有膜相关细胞器，利用 Nile Red 对脂质极性的敏感性获取 617 nm 和 685 nm 双通道比率图像作为 “光学指纹”，结合约 143 nm 分辨率的成像系统，训练 DCNN 成功分割活细胞中 15 种亚细胞结构，且迁移学习可适应不同显微镜、细胞类型及活组织，实现了有丝分裂不同阶段 3D 解剖结构的解析和 6 种细胞器快速动态相互作用的追踪，成像吞吐量较传统方法提升 6-26 倍。

一、样本制备：

采用 Nile Red 染色活细胞的膜相关细胞器（无需洗涤步骤），同时通过 GFP 质粒特异性标记单一细胞器作为 ground truth，或用 NucSpot® 染料标记细胞核等结构，针对果蝇幼虫睾丸等活组织样本同样适用 Nile Red 染色。

二、成像系统：

使用两台旋转盘共聚焦显微镜（M1 和 M2），均具备约 143 nm 或 177 nm 的扩展分辨率，通过 473 nm 或 488 nm 激光激发，采集 617 nm 和 685 nm 波段的荧光信号，获取强度图像和比率图像（反映脂质极性），部分实验还结合超分辨率结构光照明显微镜（SR-SIM）。

三、深度学习模型：

基于注意力 U-Net 架构构建 10 个 DCNN 网络，输入为强度图像和红 - 黄比率图像，通过 binary 或 multi-class 分割策略，分别负责 15 种亚细胞结构的分割（如 ER-net 分割内质网等，VOLUME-net 分割细胞核等），训练中采用数据增强和类别权重调整以提升鲁棒性。

四、验证与扩展：

通过对比预测结果与 GFP 标记的 ground truth，采用像素准确率、F1 分数、MOC 等指标评估分割性能，同时验证模型在不同显微镜、细胞类型（如 U2-OS、COS7、Hela）及活组织中的通用性，利用迁移学习优化跨系统预测效果。

研究结果

一、染色与成像系统表现：

使用 Nile Red 染色活细胞膜相关细胞器，结合旋转盘显微镜（分辨率约 143 nm 或 177 nm），在 473 nm 或 488 nm 激光激发下，采集 617 nm 和 685 nm 波段荧光，获得的光谱比率可作为细胞器 “光学指纹”，且在不同细胞系、光照强度和曝光时间下保持稳定，仅染料浓度超推荐值两倍时受影响。

二、深度学习分割结果

基于注意力 U-Net 架构的 10 个 DCNN 网络，成功分割出 15 种亚细胞结构，整体像素准确率超 91.7%；多数结构的 Manders’重叠系数（MOC）大于 0.5，部分达 0.7 以上，比率图像对形态相似的囊泡细胞器分割准确性提升显著。

三、通用性与迁移学习效果：

该方法在不同显微镜、细胞类型（如 U2-OS、COS7、Hela）中表现稳定；经迁移学习，少量额外数据可显著提升预测准确性，还能应用于果蝇幼虫睾丸等活组织成像。

四、有丝分裂阶段成像结果：

成功解析活细胞有丝分裂不同阶段的 3D 解剖结构，追踪到细胞器动态变化，如内质网在间期的密集结构与分裂期的管状分布，线粒体的形态和体积变化等。

五、细胞器动态相互作用观测：

实现 6 种细胞器快速动态相互作用的追踪，成像吞吐量较传统方法提升 6-26 倍，可观察到线粒体分裂融合、高尔基体与微管相互作用等细节。

图表1|使用旋转圆盘共聚焦显微镜和扩展分辨率的旋转圆盘共聚焦显微镜，通过通用脂质染色和深度学习分割，快速成像15个细胞内结构的活细胞解剖

图表2| 基于GFP地面真实图像的八种细胞内结构的精确电子预测

图表3| 对15个细胞结构的分割精度进行了综合评价

图表4|基于通用脂肪染色和深度学习的不同生物样本细胞器分割

图表5|对所有有丝分裂阶段的细胞解剖进行动态成像

图表6|活细胞内多细胞器动态相互作用的快速多路成像

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来源：凯视迈精密测量