摘要：多色荧光成像广泛用于生命科学中的细胞共定位、免疫标记、发育监测等研究场景，然而，如何在不牺牲分辨率与成像速度的前提下，实现高效、准确的多波段图像采集，始终是一个具有挑战性的课题。传统多色显微通常依赖滤光片轮换或多通道分束系统，在物理架构上带来了系统复杂度、光路

多色荧光成像广泛用于生命科学中的细胞共定位、免疫标记、发育监测等研究场景，然而，如何在不牺牲分辨率与成像速度的前提下，实现高效、准确的多波段图像采集，始终是一个具有挑战性的课题。传统多色显微通常依赖滤光片轮换或多通道分束系统，在物理架构上带来了系统复杂度、光路对准、通道串扰等一系列问题。此外，这类系统往往难以支持高时间分辨率，无法捕捉快速生物过程中的同步多标记动态。结构光照明显微(SIM)因其成像速度快、光毒性低而广泛应用于活细胞成像，其将高频结构信息调制至可探测带宽之内，从而突破衍射极限。然而，SIM在多色并行化上的局限性却成为制约其在复杂生物样品中推广应用的关键障碍。因此，亟需一种同时具备结构光调制能力、多光谱分辨能力与快照式数据采集能力的新型成像架构，打破传统硬件对多色超分辨率系统的约束。

在此背景下，中国科学院上海光学精密机械研究所空天激光技术与系统部韩申生研究员、刘震涛副研究员团队在多色超分辨结构光照明显微鬼成像方面取得突破，提出了一种融合快照光谱鬼成像机制的结构光照明显微方案，旨在实现设备简洁、算法驱动、信息协同的多色超分辨成像。作者创新性地将光谱鬼成像引入SIM架构中，采用多通道调制照明与单通道探测相结合的方式，在单次曝光下完成多个波长成分的空间调制编码，从而实现无需多光谱探测器即可还原多色图像。该方法基于多波段激发光源，利用数字微镜器件(DMD)产生可控的调制散斑结构，并通过荧光响应矩阵建模每个激发波段对单通道探测图像的混合响应，最终借助压缩感知重建与SIM反演算法完成图像复原。该工作在期刊《ACS Photonics》以“Multicolor super-resolution structured illumination microscopy based on snapshot spectral ghost imaging via sparsity constraints”为题发表。

基于稀疏约束快照光谱鬼成像的多色超分辨率结构照明显微(GISC-SIM)以“稀疏调制+光谱编码+快照重建”为核心，构建了一个无需滤光器、无需扫描，仅通过单帧曝光即可实现多色分离与超分辨重建的成像系统。多通道稀疏结构光编码设计稀疏性强、互相正交的结构光照明模式，在光谱维度形成解耦调制。单帧混合光强快照采集通过相机获取所有调制光响应的叠加图像，形成光谱混合图。稀疏先验反演解码引入正则化优化模型，基于稀疏性假设重建每个颜色通道对应的超分辨图像。该系统以压缩感知理论为数学基础，结合光学调制设计与计算重建算法，在保障成像分辨率的同时实现了对多色信号的准确提取。

论文首先从原理上系统构建了稀疏调制-快照鬼成像-稀疏重建这一完整的成像链条。基于多通道稀疏结构光照明策略，系统通过预设计的调制矩阵对RGB通道分别进行散斑调制，调制矩阵之间具备良好的正交性和稀疏性，从而保证在混合光强中可实现谱间解耦。单帧曝光过程中，相机同步记录由三通道编码响应叠加而成的快照图像，该图像不再携带显式颜色信息，而是将颜色隐含在调制响应之中。基于这一编码关系，研究团队进一步构建了稀疏反演模型，并引入了联合稀疏先验约束，通过最小化残差与L1正则项之间的代价函数，利用迭代重建算法从快照中逐通道提取出清晰、独立、超分辨的多色图像。

图1系统性呈现了该文提出的多色超分辨结构光显微成像方法GISC-SIM的基本架构、频谱增强机制与多通道快照采集策略，全面反映了该方法在空间与时间分辨率层面的协同提升能力。通过(a)系统结构图、(b)频谱性能图与(c)采集效率图的三重展示，构建出该文提出的GISC-SIM方案在光学设计、成像原理与算法支撑之间的高度协同机制，突显了其在低复杂度光路条件下实现高维、多通道、快照式超分辨成像的前沿潜力。

图1(a)展示了GISC-SIM系统的光学架构图。从整体构型来看，系统基于三色LED照明源构建，每种颜色的光源均通过独立的稀疏调制器生成特定的结构化照明图案，进而经共轴光路照射至样本区域。这些稀疏图案具有良好的空间互补性和统计正交性，使得三种颜色在空间上混合投影至样本面，但在编码域保持解耦。所有颜色信号在目标样本经过散射、衍射等相互作用后被单台探测器所接收，从而实现了三色照明图案的同步采集。这一系统结构显著区别于传统多通道成像系统，后者往往需要多个物理通道、滤光片轮换或多个探测器才能完成多色成像任务。GISC-SIM以极简的光学架构实现三色编码图案的并行调控与快照获取，大大简化了系统复杂度并提升了采集效率。图1(b)所示为系统在空间频率域中的性能增强原理图。

该图分别呈现了传统显微成像、传统SIM与GISC-SIM在频谱覆盖能力上的差异。传统显微系统仅能探测低频区域的样本信息，因其照明方式不具备频谱调制能力，导致高频细节信息无法采集。而SIM技术通过周期性照明图案引入频谱迁移，拓展了可感知频率范围，但其频谱扩展仍受限于调制图样的周期性与强度调控。相比之下，GISC-SIM采用稀疏调制策略，利用非周期性图案引入非对称频谱折叠，并结合稀疏重建算法在频域进行信息补偿与拓展，使得系统可获得比传统方法更广泛的频谱响应能力，从而在理论与实验上实现更高的空间分辨率。图1(c)进一步从数据采集维度揭示了GISC-SIM在成像效率上的突破。传统三色SIM成像系统在每种结构光照明状态下需分别获取红、绿、蓝三个光谱通道的图像，即每种照明图案对应三帧采集，导致数据量成倍增加，且在动态样本成像中易产生帧间失配。而GISC-SIM在每个稀疏照明图案下仅需一次曝光，即可通过光谱编码同时获取三色图像混合信息，后续借助解混合算法将其准确分离。如此便将原本冗长的采集流程压缩至最小帧数，极大提升了系统在多通道成像下的时间分辨率与实用性，尤其适合活体细胞、快速动态过程等苛刻成像场景。

多色荧光显微成像系统的整体光学实现架构如图二所示，该架构揭示了GISC-SIM系统在实验层面的具体构建方式。该系统基于三通道的多波段荧光激发与快照式编码采集设计，实现了对多色信息的同步调制与解码。实验系统采用三组波长互异的LED光源作为激发源，分别通过带通滤波器进行波段纯化，确保激发光谱的选择性与通道独立性。经过两片分色镜的合束后，三色光被导入DMD进行稀疏结构光图案的加载与投影，最终通过微缩成像系统照射于待测荧光样本，实现了多通道结构化照明的同时作用。

在荧光信号收集路径中，系统设计了传统成像路径与稀疏约束鬼成像(GISC)路径并行架构。前者直接对发出的荧光进行成像，支持常规多色SIM采集；后者则引入了相位调制器，对荧光波前进行调控，从而形成满足稀疏性约束的编码模式。经调制后的荧光信号最终被采集用于GISC重建，能够在单次曝光下实现多通道图像的解混与高分辨重构。虽然两种成像路径采用了不同的探测器，但通过对光路分光比与调制方式的合理设计，确保了信号能量分布的相对一致性，为对比分析提供了等效检测基础。在多波长设计方面，系统使用了一片多通带滤光片以同时透过三种所需荧光通道，避免了传统多色成像中频繁滤片切换所带来的机械延迟与时间开销。借助三种发射波长明确的荧光微球进行系统标定后，该系统能够在无需物理分光切换的前提下，实现多色图像的同时采集，大幅提升了成像效率与通道同步性，尤其适用于生物体快速动态过程的高时效观测。结构光的生成方面，系统采用DMD加载的二值光栅图案投影方式，规避了传统干涉型结构光所需的相干系统构建与干涉噪声干扰。通过精确控制图案周期，实验实现了接近系统截止频率的结构照明，使重建图像在空间分辨率上获得有效增强。为避免调制度过低影响传统SIM算法的解码精度，实验中选取了适中频率的结构光图案，在保证重建精度的同时提升了算法鲁棒性。此外，为了实现高保真的稀疏重建，GISC路径中的相位调制器采用了根据衍射传播理论反演优化的调制图案，相较于随机调制具备更高的散斑对比度与低光子条件下的成像优势。该相位调制策略与GISC重建算法协同工作，共同提升了在低信噪比、多通道条件下的分辨能力与图像保真度。实验样本包括不同颜色的荧光微球与染色的植物组织，为多色重建的系统性能评估与生物应用验证提供了全面支撑。

图3系统地展示了本文对成像空间分辨率进行定量评估的实验过程与结果，其核心在于通过100 nm荧光微球样本对不同成像方法的空间解析能力进行逐级对比分析，以直观验证所提出GISC-SIM方法的超分辨性能。该图由(a)–(d)四个子图构成，分别从宏观成像结果、局部放大图、强度剖面与统计量化指标四个维度呈现数据。

在图3(a)中，文中分别给出了同一视野下采用四种成像模式获得的图像重建结果，依次为传统宽场成像(Widefield)、维纳滤波结构光成像(Wiener-SIM)、稀疏先验结构光成像(Sparse-SIM)以及本文提出的GISC-SIM。可以明显观察到，随着方法的逐步增强，荧光微球的边界逐渐变得清晰，信号聚焦性增强，背景干扰减少，表明成像分辨率与图像保真度在持续改善。为了更精确地揭示微观结构上的分辨力差异，图3(b)对图3(a)中红色矩形框区域进行了放大处理，从视觉细节层面进一步验证了GISC-SIM在点扩散压缩与图像锐化方面的优势。相比传统宽场成像中明显展宽的荧光斑点，GISC-SIM所重建的微球边界紧凑、过渡陡峭，充分体现出高空间频率信息的恢复能力。图3(c)进一步给出了图3(b)中各方法下微球的归一化荧光强度横截面剖面曲线。该剖面反映了系统在实际成像中的点扩散函数(PSF)响应形态。可以清楚看到，GISC-SIM所对应的强度分布曲线主瓣最窄、旁瓣最低，侧重能量集中，主峰突出，这说明该方法在高频信息重建中具有最优的能量聚焦性能，有效抑制了图像模糊与空间展宽问题。最后，在图3(d)中，作者统计了图3(a)中80个独立荧光微球的强度剖面全宽半高（FWHM）值，以此作为定量表征成像空间分辨率的指标。从统计结果可见，GISC-SIM在所有方法中获得了最小的平均FWHM值，且波动范围最窄，验证了其分辨率提升不仅在个例上有效，更具有广泛的普适性与重建稳定性。这一结果也体现了稀疏先验解调机制对图像重建精度的正向贡献，尤其是在低信噪与多通道融合条件下，展现出良好的稳健性。图3(a)–(d)所呈现的多层次分析充分说明，本文提出的GISC-SIM方法在保持高通道兼容性与成像速度的同时，显著提升了空间分辨率，已接近衍射极限甚至部分超越传统SIM方法，在荧光点源成像场景下展现出极具竞争力的光学解析能力。

图4展示了GISC-SIM方法在实际荧光样本上的超分辨成像性能评估，进一步从复杂组织结构重建的角度验证了该方法在生物显微成像中的应用潜力。相较于图3中的点源成像测试，本部分实验更贴近真实样本环境，包含细胞边界、胞间质等亚细胞尺度结构，具有更高的成像挑战性与评价说服力。

图4(a)呈现了玉米茎横切细胞样本在四种成像模式下的全视野成像结果，包括Widefield、Wiener-SIM、Sparse-SIM以及GISC-SIM。可以观察到，随着方法的递进，图像中细胞壁轮廓、胞间空隙及纤维结构逐渐清晰，尤其在GISC-SIM图像中，细胞边界呈现出更锐利的过渡与更高的对比度，有效还原了微细结构。对应地，图4(d)给出了另一个典型样本——苏铁叶细胞的多模式成像结果，重现了细胞层叠分布与膜状结构的局部特征，同样在GISC-SIM下表现出最佳的结构可分辨性。图4(b)和(e)进一步放大了(a)与(d)中红色矩形区域，对微观结构的局部对比进行了视觉强化。可见在宽场成像与Wiener-SIM模式下，细胞结构边缘存在明显的模糊与混叠，Sparse-SIM则通过稀疏先验部分恢复了高频信息，而GISC-SIM图像中的边界清晰锐利，细节充沛，局部信号分布均匀，图像背景噪声显著抑制，体现出在结构复杂样本中的重建优势。为进一步提供定量支撑，图4(c)与(f)分别给出了(b)与(e)图像中红线区域的荧光强度剖面曲线。这些曲线直观呈现了细胞边界在不同方法下的空间解析能力与灰度过渡变化。传统宽场成像的剖面展宽严重，峰值不清晰，过渡缓慢，而GISC-SIM曲线表现为陡峭主峰与清晰分离的双峰结构，主瓣宽度明显收窄，能够准确分辨相邻的细胞界面与内部结构。这一特性对后续进行定量分析（如测量细胞尺寸、分布密度、荧光强度等）提供了坚实基础。图4(a–f)通过两种复杂的生物组织样本、四类成像方法、三层图像解析视角（全图、局部放大与强度剖面）系统展现了GISC-SIM方法的多色超分辨优势。相比传统SIM方法，GISC-SIM不仅在结构还原质量上显著提升，且不依赖复杂的干涉光路与多次通道切换，展示出更高的成像灵活性与工程实用性。

图5呈现了三色荧光微球在不同成像模式下的重建效果，是本研究验证多通道成像能力与光谱解耦性能的核心实验证据。该实验不仅考察了GISC-SIM系统对多通道信号的分辨能力，也从视觉效果与强度剖面等维度系统对比了其与传统方法的分辨性能，为方法的多色成像实用性提供了直观而充分的证明。

图5(a)显示了三种荧光微球（中心激发波长分别为470  nm、565  nm、660  nm）在Widefield、Wiener-SIM、Sparse-SIM以及GISC-SIM四种模式下的成像结果。三类微球在图中分别表现为蓝、绿、红三种发射通道的响应点，通过宽场成像可以观察到较为模糊的信号叠加，多个通道间界限不清；随着成像模式升级，SIM方法逐步改善空间解码能力，其中GISC-SIM图像呈现出最佳的颜色分离度和空间聚焦度，三色微球边缘轮廓分明，交叉区域基本无混叠，展示了该方法在瞬时多通道解调方面的优越性能。为了进一步验证系统对三色微球的分辨能力，图5(b)、(d)、(f)分别给出了(a)图中白色矩形区域的放大图像，对应三种不同颜色荧光微球的局部细节呈现。从局部图中可以更直观地看出，GISC-SIM不仅在空间分辨率上更胜一筹，且在色彩保真度上明显优于Wiener-SIM与Sparse-SIM，有效克服了多光谱信号重叠导致的色散失真问题。图5(c)、(e)、(g)进一步分别给出了(b)、(d)、(f)中红色虚线区域的荧光强度剖面曲线，展示了在三个通道中微球信号的光强分布规律。曲线对比清晰表明，在传统宽场或Wiener-SIM中，多个微球信号常呈现出主峰模糊、边界不清、光强渐变缓慢的趋势，反映出系统对不同波长信号存在混叠或解调不彻底的问题。而在GISC-SIM模式下，剖面曲线主峰陡峭、峰宽最小，且不同通道信号之间具有显著的间隔，反映出该方法具备良好的光谱选择性与横向分辨能力，能够有效解耦并保留多通道荧光信息。整体而言，图5通过从全图到局部放大再到灰度曲线三重层级，系统性展现了GISC-SIM在多色荧光微球成像中的卓越表现。相比传统宽场与基于维纳滤波或稀疏先验的SIM方案，GISC-SIM不仅能够在单次曝光中同时实现多个光谱通道的快速成像，还能在不牺牲空间分辨率的前提下确保光谱信息的完整分离，为复杂样本中的多色定位、共定位分析与动态响应提供了有力工具支持，验证了其在高通量、多色超分辨荧光成像中的广泛适用性。

从成像性能评估来看，GISC-SIM在多个维度均优于传统方法。无论是从FWHM指标对空间分辨率的提升幅度，还是从SSIM、PSNR等图像质量指标的提升结果来看，该方法均表现出优秀的重建能力与抗噪性能，特别是在多通道快速成像场景下，其在空间分辨、时间同步与光谱分离之间实现了良好的权衡。尽管如此，文章亦指出了GISC-SIM仍面临的一些技术挑战，例如系统在更宽光谱范围内的色散控制、多目标稀疏先验建模的准确性、相位调制器的快速响应能力等问题，在未来的工作中，这些问题或可通过引入自适应光学控制、深度神经网络辅助重建或新型超构光学器件进一步优化。

综上所述，该文所提出的GISC-SIM技术在多色荧光显微领域提供了一种新颖而有效的成像策略，其在结构设计、调制方法与重建算法等多个环节的创新为高通量、多光谱、超分辨成像的发展提供了坚实基础。该方法的快速性、分辨率提升能力与系统集成潜力，使其在活细胞动态观测、多标签组织切片分析、以及临床高通量荧光检测等场景中具备广泛的应用前景，代表了当前多色超分辨成像技术迈向“高效、紧凑、智能”发展的重要方向。

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来源：凯视迈精密测量