研究人员无需暗态就实现了纳米级分辨率，扩展非荧光分子和非光波

摘要：STED和 PALM/ STORM显微镜以及所有其他超分辨率荧光显微镜提供的分辨率仅为光波长（纳米）的一小部分。然而，要单独对相邻的荧光分子进行成像，必须将它们暂时转换为非发光暗态（OFF）。Stefan Hell 领导的团队现在已经将永久荧光分子分辨率降低到

STED和 PALM/ STORM显微镜以及所有其他超分辨率荧光显微镜提供的分辨率仅为光波长（纳米）的一小部分。然而，要单独对相邻的荧光分子进行成像，必须将它们暂时转换为非发光暗态（OFF）。Stefan Hell 领导的团队现在已经将永久荧光分子分辨率降低到几纳米- 而无需使用暗态。超分辨率的新概念也应适用于高对比度、非荧光分子以及基于非光波的成像模式。

该研究成果发表在《自然物理学》（“衍射最小值解析百分之几波长的点散射体”）。

克服光学显微镜中大约半波长（约 250 纳米）的分辨率极限是光学领域最重要的发展之一。由于光的波动性，即使是最好的镜头也无法产生直径小于 250 纳米的光斑。这个亮点内的所有

分子同时被照亮，一起发光，因此看起来像一个模糊的整体，不可分割。

20 世纪 90 年代初，Stefan Hell 意识到，只需短暂地将分子信号“关闭”和“打开”即可分离分子，这样相邻的分子就被迫连续发出信号。连续发出信号的分子很容易被区分。

在荧光显微镜中，这种开/关分离原理可以完美实现，因为分子荧光可以轻松打开和关闭。事实上，STED 和 PALM/STORM 以及较新的超分辨率荧光显微镜都是基于这种开/关原理。将附近的分子短暂地从荧光开启状态转移到非荧光关闭状态，反之亦然，成为超分辨率荧光显微镜这一新兴领域的基础。

2014年，斯蒂芬·赫尔与美国科学家埃里克·贝齐格（Eric Betzig）和威廉·E·莫纳（William E. Moerner）因发明超分辨率荧光显微镜而共同获得诺贝尔化学奖。

无开关超分辨率

由 Hell 领导的德国哥廷根马克斯普朗克多学科科学研究所 (MPI) 和德国海德堡马克斯普朗克医学研究所的科学家团队现已证明，无需开关，即可分离可数的分子。研究人员通过实验证明，分子等点状物体可以清晰地分离到 8 纳米的微小距离。

为此，他们用中心为零强度线（节点）的光束扫描分子。当光束扫描样品时，测量信号被记录下来；对于荧光分子，信号就是荧光。对于单个荧光分子，当且仅当照明光束的零强度节点与分子的位置匹配时，信号才为零。

然而，如果样本中含有两个或更多个相邻分子，则测量信号不能为零。这是因为，无论如何，至少一个分子不能与照明光的零强度点重合。因此，分子的位置被编码在测量信号与零的偏差中。

文本

科学家们从理论和实验上都证明了“以最小强度扫描”这一原理可用于非常精确地确定分子位置。例如，他们能够在 8 纳米的距离内分离两个永久发射荧光团。他们还在约 20 纳米的距离内分辨出一组 3 或 4 个分子。“自从三十多年前引入 STED 原理来关闭荧光以来，开/关切换一直被认为是光学高分辨率的必要先决条件。仅用最小强度分离持续发射分子的概念是一项突破，”Stefan Hell 解释道。

这项研究的第一作者、赫尔团队的博士生托马斯·亨塞尔 (Thomas Hensel) 指出：“有了这个新概念，从理论上讲，在空间上记录距离较近的分子比记录距离较远的分子更容易。这一点并不明显，因为它颠覆了关于分辨率的直觉。”

以前，分子之间的距离越近，就越难分辨。如果像过去那样使用明亮的光点和产生的信号最大值来分离分子，那么由于各个分子的信噪比，很难区分它们。Hell 补充道：“如果你处理一个暗点或节点并检查信号与零的偏差，它实际上恰恰相反。”

无分辨率限制的波浪成像

马克斯·普朗克科学家认为他们的研究成果具有巨大的潜力：“用最小距离分辨的理念不仅适用于荧光分子，而且通常适用于任何提供良好对比度信号的分子。它不仅适用于光波，例如光，原则上适用于任何类型的波，”Hell 说。“在最小距离上分辨而不开启或关闭非常重要，因为它允许连续观察所有分子。无需关闭分子，不会造成中断。”

持续观察开辟了另一个应用：如果分子机器（如蛋白质或蛋白质复合物）在不同点用不断发出信号的分子标记，人们就应该能够跟踪它们位置的细微变化，从而有可能“拍摄”这些纳米级生命机器的实际工作。在未来，这可以帮助设计药物，根据需要阻止或支持特定蛋白质发挥其功能。通过提供对蛋白质如何以机械方式工作的见解，这种显微镜方法最终甚至可能加速药物发现。