摘要：从牛心肌中纯化的肌钙蛋白/原肌球蛋白复合物（TT复合物）（1）。TT复合物由五种蛋白质组成：原肌球蛋白α、原肌球蛋白β、肌钙蛋白C、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T，其化学计量比为1:1:1:1:1（见图1）。该复合物已在F-肌动蛋白/钙激活肌球蛋白ATP酶检测中被确定

从牛心肌中纯化的肌钙蛋白/原肌球蛋白复合物（TT复合物）（1）。TT复合物由五种蛋白质组成：原肌球蛋白α、原肌球蛋白β、肌钙蛋白C、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T，其化学计量比为1:1:1:1:1（见图1）。该复合物已在F-肌动蛋白/钙激活肌球蛋白ATP酶检测中被确定具有生物活性（见生物活性检测）。该复合物以白色冻干粉的形式提供。

纯度：

通过扫描分光光度法测定考马斯亮蓝染色的蛋白质在4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶上的纯度。TT复合物的纯度被确定为85%（见图2a）。使用针对每个组分的抗体来验证每个组分的存在（见图2b）。

图2a：20 µg的TT复合物蛋白在4-20% SDS-PAGE系统中通过电泳分离，并用考马斯亮蓝染色。箭头1表示肌钙蛋白T（38 kDa），箭头2表示原肌球蛋白（α+β，32 kDa），箭头3表示肌钙蛋白I（24 kDa），箭头4表示肌钙蛋白C（18 kDa）。

图2b：2 µg的TT复合物蛋白在4-20% SDS-PAGE系统中通过电泳分离，转印到PVDF膜上，并用特异性单克隆抗体进行探针检测。泳道3：原肌球蛋白（α+β，32 kDa，单克隆抗体克隆：TM311），泳道4：肌钙蛋白T（38 kDa，单克隆抗体克隆JLT-12来自Sigma）（抗体给出24 kDa信号——与肌钙蛋白I交叉反应？），泳道5：肌钙蛋白I（24 kDa，单克隆抗体克隆MAB1691），泳道6：肌钙蛋白C（18 kDa，单克隆抗体克隆7B9）。

艾美捷原肌球蛋白/原肌球调节蛋白复合物,牛心脏（#CS-TT05）用途：

1测量与细丝结合时的钙激活肌球蛋白ATP酶活性。

2识别/表征影响TT复合体调控和肌球蛋白ATP酶活性的蛋白质或小分子。

3识别/表征影响肌球蛋白/F-肌动蛋白相互作用的蛋白质或小分子。

储存与复溶：

短暂离心以将产品收集到试管底部。通过加入冰冻的Milli-Q水将蛋白质复溶至3 mg/ml。蛋白质将处于以下缓冲液中：20 mM PIPES，pH 7.0，25 mM KCl，5%（w/v）蔗糖和1%（w/v）葡聚糖。为了保持蛋白质的高生物活性，建议将蛋白质溶液分装成“实验用量”，在液氮中快速冷冻并储存于-70°C。如果储存于-70°C，蛋白质可稳定保存6个月。蛋白质不应暴露于反复的冻融循环中。冻干的蛋白质在4°C干燥（

生物活性检测：

TT复合物的生物活性可以通过其调节F-肌动蛋白激活肌球蛋白ATP酶的能力来确定。检测方法是首先使肌动蛋白聚合形成F-肌动蛋白，然后将TT复合物与肌动蛋白丝以化学计量比混合。这会形成类似于肌肉纤维细丝的包被丝。这些丝在100,000×g下离心，沉淀物在反应缓冲液中重新悬浮，从而纯化钙敏感复合物。肌球蛋白以亚化学计量比加入，并用ATP和钙启动反应。严格的质量控制确保在没有钙的情况下，TT复合物完全抑制肌球蛋白ATP酶。加入10 µM钙后，肌球蛋白ATP酶将被恢复。钙与肌钙蛋白C结合，使其从F-肌动蛋白上解离，从而允许肌球蛋白结合。

试剂

1. 心脏TT复合物（1×1 mg，货号TT05）

2. 心脏肌球蛋白S1（0.25 mg），货号MYS03

3. 心脏肌动蛋白（1 mg，货号AD99-A）

4. ATP酶生化试剂盒（货号BK051）

5. 50 mM Tris-HCl，pH 7.5中的100 mM ATP（100 µl）

6. 水中的1 M二硫苏糖醇（100 µl）

7. PM12反应缓冲液（12 mM Pipes-KOH，pH 7.0，2 mM MgCl₂）

8. 500 mM EGTA-Na，pH 8.0

设备：

1. 能够在360 nm（±5 nm带宽）处测量吸光度的分光光度计。推荐使用Spectra-Max M2（Molecular Devices），基于滤光片的机器不适合。

2. 半面积96孔微量滴定板（Corning货号3696或3697）

3. 多通道移液器

以下为主要步骤：

步骤1：准备所需的试剂和化合物。（30分钟）

步骤2：制备F-肌动蛋白聚合物储备液。（1小时）

步骤3：制备细丝储备液。（1.5小时）

步骤4：准备马达混合物和酶标仪。（15分钟）

步骤5：将马达混合物加入孔中并启动反应/酶标仪。（10分钟）

F-肌动蛋白聚合物储备液：

1. 用2.5 ml缓冲液将AD99复溶至0.4 mg/ml（测量蛋白浓度以获得更好的可重复性），缓冲液成分：5 mM Pipes-KOH，pH 7.0，500 µM ATP，500 µM DTT。

2. 在室温下放置10分钟以溶解肌动蛋白。

3. 然后加入2.0 mM MgCl₂和2.0 mM EGTA，在室温下孵育20分钟以聚合。（室温下保质期1小时）

原肌球蛋白/原肌球调节蛋白复合物,牛心脏文献参考：

1. J.M Murray. 1982. Hybridization and reconstitution of the thin filament. Methods in Enzymology, 85, p.15-17.

2. M.J. Holroyde et al. 1980. The calcium and magnesium binding sites on cardiac troponin their role in the regulation of myofibrillar adenosine triphosphatase.

来源：科学从未如此性感