摘要：每一个细胞都是一个独立而精彩的世界，探索这些微观世界的多样性与复杂功能，是理解生命奥秘、攻克人类疾病的关键。近年来，单细胞测序 (single-cell sequencing) 技术的崛起，如同一场革命，让我们首次获得了聆听单个细胞“心声”的能力。
引言
每一个细胞都是一个独立而精彩的世界，探索这些微观世界的多样性与复杂功能，是理解生命奥秘、攻克人类疾病的关键。近年来，单细胞测序 (single-cell sequencing) 技术的崛起，如同一场革命，让我们首次获得了聆听单个细胞“心声”的能力。
然而，这场革命并非一帆风顺。现有的技术路径，常常迫使研究人员在“广度”（通量）与“深度”（灵敏度）之间做出艰难的取舍。我们渴望拥有一双“上帝之眼”，既能一次性检阅百万细胞组成的“军团”，又能清晰洞察每个“士兵”的装备（基因表达）、身份（细胞类型）、甚至是它与战友的“窃窃私语”（相互作用）。我们不禁要问：是否存在一种技术，能够打破这种“鱼与熊掌不可兼得”的困境？它能否像一台超高分辨率的广角摄像机，既能捕捉到细胞社会的宏大场面，又不失每一个体的精微细节？
8月21日，《Science》的研究报道“Stereo-cell: Spatial enhanced-resolution single-cell sequencing with high-density DNA nanoball-patterned arrays”，给出了一个响亮的回答。这项名为Stereo-cell的新技术，正如其“立体”之名所昭示的，旨在提供一个前所未有的、整合了空间维度与多组学信息的高通量单细胞分析框架。它不仅是一次技术的迭代，更像是一场范式的转换，引领我们从“平面化”的细胞认知，迈向一个更加真实、动态和“立体”的细胞宇宙。
想象一下，对一个庞大的细胞群体进行普查，传统的高通量单细胞测序技术，如微流控液滴法 (droplet-based methods)，就像是为每个细胞分配一个独立的“小隔间”（油滴），然后在这些隔间里分别完成信息登记（RNA捕获与标记）。这种方法的巧妙之处在于实现了大规模的并行处理，但“小隔间”本身也带来了诸多限制。
首先，隔间的“门框”大小是固定的，这使得体型过大的细胞（如卵母细胞、心肌细胞）或结构特殊的细胞（如多核的骨骼肌纤维）难以进入，导致了严重的“取样偏好”。其次，细胞进入隔间的过程是随机的，总有一些细胞因为“害羞”或物理特性的差异而不愿意进入，造成某些细胞类型比例的失真。此外，有时两个或多个细胞会挤进同一个隔间，形成“双胞胎”或“多胞胎” (doublets)，给后续的数据分析带来混淆。最重要的是，一旦细胞被装进隔间，它们便与原来的“社区”环境彻底隔离，所有关于“邻里关系”和空间位置的宝贵信息都丢失了。
Stereo-cell的诞生，其核心思想就是——彻底拆除这些“小隔间”。
它的实现基础是一张布满了高密度DNA纳米球 (DNA nanoball, DNB) 的特殊芯片。这些DNB，直径约220纳米，彼此间隔500纳米，每一个DNB上都带有独特的分子条形码 (barcode) 和用于捕获信使RNA (mRNA) 的探针。研究人员首先用多聚赖氨酸 (poly-L-lysine) 对芯片表面进行预处理，使其带上正电荷。当携带负电荷的细胞悬液被滴到芯片上时，细胞们便会通过静电相互作用，温和而牢固地“坐”在芯片表面的指定“座位”上。
这个过程完全是“无封装”的 (encapsulation-free)。细胞以其最自然的状态附着，没有物理隔间的筛选和挤压。接下来，通过原位 (in situ) 的细胞通透、逆转录等一系列生化反应，每个细胞释放的mRNA会被其正下方的DNB探针阵列捕获。由于DNB阵列具有纳米级的空间分辨率，后续测序得到的数据不仅告诉我们“哪个基因被表达了”，还精确地记录了表达这个基因的RNA分子“源自芯片上的哪个坐标”。
通过这种方式，Stereo-cell巧妙地将细胞的转录组信息与其物理空间位置牢牢绑定。这不仅从根本上解决了细胞大小和类型的兼容性问题，还为后续整合影像学分析、探究细胞微环境保留了最原始的“现场快照”。这正是Stereo-cell能够实现“立体”观测的基石。
一项新技术是否优秀，必须经过严格的“实战检验”。研究人员选择了一个经典的战场——人类外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 的分析，并让Stereo-cell与目前广泛应用的“老大哥”——10x Genomics Chromium平台进行了一场正面对决。PBMCs是一个成分复杂的细胞大家族，包含T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞等多种免疫细胞，是检验单细胞技术性能的“试金石”。
普查的准确性。一项理想的细胞普查技术，应该能真实反映各种细胞在群体中的实际比例。研究人员首先使用流式细胞术 (flow cytometry) 这一公认的“金标准”方法，测定了样本中主要细胞类型的比例。结果显示，CD14+单核细胞的比例为17.1%。随后，他们用两种单细胞技术进行了分析。令人惊讶的是，10x Genomics平台的数据显示单核细胞比例高达28.31%，出现了明显的“富集”现象。而Stereo-cell的测量结果为16.79%，与流式细胞术的结果惊人地吻合。这种高保真度同样体现在T细胞、B细胞和NK细胞等其他主要细胞类型的比例上。这有力地证明，Stereo-cell的开放式捕获系统能够更无偏好地 (unbiased)记录细胞群体的原始构成，避免了因细胞物理化学特性差异导致的捕获效率偏差。
信息的完整度。在相同的测序深度下（标准化为每个细胞20,000条读取），谁能从每个细胞中挖掘出更多的信息？数据显示，Stereo-cell平台检测到的基因和转录本（以UMI计数）中位数均显著高于10x Genomics平台。同时，Stereo-cell捕获的线粒体基因比例更低。在单细胞分析中，高比例的线粒体基因通常被认为是细胞状态不佳或捕获过程引起细胞应激的标志。这一结果暗示，Stereo-cell温和的细胞处理流程可能更好地保护了细胞的生理状态，从而获得了更高质量的转录组数据。
自身的稳定性。技术的可靠性体现在其可重复性上。研究人员用Stereo-cell对PBMC样本进行了两次独立的技术重复实验。结果显示，两次实验的平均基因表达谱具有极高的相关性，其决定系数R² 高达0.9994。这表明Stereo-cell平台性能稳定，能够提供高度一致和可靠的实验结果。
在这场对决中，Stereo-cell无疑交出了一份优异的答卷。它不仅在细胞类型代表性上表现出更高的准确度，在数据质量和技术稳定性上也展现了强大的竞争力。这是否意味着，单细胞研究领域将迎来一个新的、更精准的“人口普查”时代？
在细胞的汪洋大海中，除了那些占主导地位的常见细胞类型，还漂浮着许多数量稀少但功能至关重要的“稀有细胞”，例如干细胞、循环肿瘤细胞等。它们如同“幽灵”一般，在庞大的细胞群体中若隐若现，难以捕捉。要研究这些细胞，唯一的办法就是极大地提升检测的通量，将“大海”浓缩成“池塘”，让“捞针”成为可能。
Stereo-cell技术的一个核心优势在于其卓越的可扩展性 (scalability)。由于其芯片制造的灵活性，研究人员可以根据需要制备不同尺寸的芯片，从1平方厘米的S1芯片，到36平方厘米的S6芯片，甚至是169平方厘米的S13芯片。这意味着，单次实验能够处理的细胞数量可以轻松地从几千个扩展到数十万，甚至近百万个。
为了验证这种“以量取胜”的能力，研究人员分别使用了0.25平方厘米 (S0.5)、9平方厘米 (S3) 和36平方厘米 (S6) 的芯片，对PBMC样本进行了超高通量的分析，成功捕获了约5000、13.5万和44.5万个单细胞。随着细胞捕获数量的指数级增长，一个激动人心的发现出现了。
在S3和S6芯片产生的大规模数据集中，研究人员成功鉴定出了一群极为罕见的细胞群体——造血干/祖细胞 (hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs)。这些细胞在PBMC中的含量通常低于0.05%，在常规通量的单细胞测序中极难被稳定地检测到。通过其特异性分子标记CD34的表达，这个稀有的细胞群在数万乃至数十万细胞构成的UMAP降维图中清晰地浮现出来，形成了一个独立的簇。
这一发现不仅仅是一次简单的“细胞鉴定”，它深刻地揭示了超高通量对于生命科学研究的革命性意义。它意味着我们现在有能力在一次无偏好的筛选中，从复杂的临床样本（如血液、体液）中“钓”出那些极其稀少的、与疾病发生发展密切相关的关键细胞。这为癌症的早期诊断、微小残留病灶的监测以及干细胞生物学的研究打开了一扇全新的大门。Stereo-cell强大的扩展能力，让“大海捞针”不再是一个比喻，而成为了实验室中触手可及的现实。
一个细胞的完整故事，并不仅仅写在它的RNA转录本里。蛋白质作为生命功能的直接执行者，其种类和数量同样是定义细胞身份和状态的关键信息。此外，细胞的外观形态、它在组织中的“邻居”是谁，这些视觉信息同样蕴含着丰富的生物学内涵。单纯的转录组数据，就像是阅读一本只有文字的小说，而我们更希望能看到配有精美插图的版本。
Stereo-cell的平面芯片设计，使其能够与各种成像技术“无缝衔接”，实现真正的多模态 (multimodal)分析。
首先是为细胞“画像”——整合多重免疫荧光 (multiplex immunofluorescence, mIF)。在进行转录组捕获之前，研究人员可以像在载玻片上一样，对芯片上的细胞进行标准的免疫荧光染色。他们使用DAPI染料标记细胞核（蓝色），用麦胚凝集素 (WGA) 标记细胞膜（红色），并用带有荧光标记的抗体去标记特定的蛋白质，例如用FITC标记T细胞表面的CD3蛋白，用TRIFIC标记幼稚T细胞的CD45RA蛋白。染色完成后，通过显微镜拍照，就得到了一张高清的细胞“彩色照片”。随后再进行转录组测序。由于转录组数据和荧光图像都带有精确的空间坐标，两者可以完美地叠加在一起。结果显示，基于转录组数据定义的T细胞区域，与CD3蛋白的荧光信号区域高度重合。这种“所见即所得”的验证，不仅极大地增强了细胞类型鉴定的准确性，还首次让我们能够同时看到一个细胞的“外在容貌”和“内在基因表达谱”。
其次是为细胞打上更精细的“蛋白质纹身”——整合CITE-seq。CITE-seq (Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) 是一种巧妙的技术，它使用带有寡核苷酸标签的抗体来识别细胞表面蛋白，从而将蛋白质的检测也转化为一种测序信号。研究人员开发了名为Stereo-cell-CITE的工作流程，他们用一个包含154种抗体的“鸡尾酒”库来处理PBMC细胞。这些抗体分别靶向免疫细胞上各种重要的表面标志物。结果，Stereo-cell-CITE不仅成功捕获了高质量的转录组数据，也同时获得了每个细胞详尽的蛋白质表达谱。
这种RNA和蛋白质的双重信息带来了惊人的解析力。例如，在仅凭RNA数据难以区分的T细胞群体中，蛋白质数据显示其中存在一个高表达CD112（一种参与免疫细胞相互作用的粘附分子）的亚群。这个亚群在功能上可能扮演着独特的角色，但在“纯文本”的转录组世界里，它被完全淹没了。
研究人员还进行了一项刺激实验，用PMA和离子霉素 (ionomycin) 模拟免疫激活过程。Stereo-cell-CITE清晰地捕捉到了这场“免疫风暴”：在RNA层面，细胞上调表达了大量的细胞因子和趋化因子，如 IL-2和CXCL8；在蛋白质层面，细胞表面的L-选择素 (CD62L) 和CD16等激活相关分子的表达显著下调。这种双管齐下的观察，为我们描绘了一幅动态、完整且高度关联的免疫细胞激活图景。
通过整合mIF和CITE-seq，Stereo-cell不再是一个单纯的转录组测序工具，它进化成了一个强大的多维信息整合平台。它让我们不仅能“听其言”（RNA），更能“观其行”（蛋白质）和“察其色”（形态），从而对细胞的生命活动获得一种前所未有的、全方位的深刻理解。
生命并非孤立细胞的简单堆砌，而是一个高度互联的社会网络。细胞间的“对话”、它们与周围微环境的互动，决定了组织的形成、器官的功能乃至整个生命体的命运。Stereo-cell的平面芯片不仅能容纳悬浮细胞，其表面同样支持细胞贴壁生长和培养，这为直接“直播”细胞社区的社会生活提供了一个完美的舞台。
研究人员将NIH-3T3成纤维细胞（一种常见的贴壁细胞）直接培养在Stereo-cell芯片上。经过64小时的培养，细胞在芯片上伸展、游走、形成网络。此时再进行原位测序，研究人员捕捉到了一些非同寻常的信号。
首先是意外的“访客”——细胞外囊泡 (extracellular vesicles, EVs)。在细胞群体中，他们发现了一些非常小的、基因表达量极低的信号聚集区（在UMAP图上表现为簇0、6、9）。通过空间位置的可视化，这些信号点往往出现在成纤维细胞伸出的“触手”（树突）附近。有趣的是，这些信号点高表达的基因，如Gphn、Cops2和Cops5，都是已知的细胞外囊泡相关基因。细胞外囊泡是细胞分泌的“信使包裹”，在细胞间通讯中扮演着重要角色。为了证实这些信号确实来源于EVs，研究人员利用了专门的生物信息学算法SEVtras进行分析，确认了这些区域具有EVs的转录组特征。更进一步，他们通过免疫荧光染色，在芯片上的细胞周围区域检测到了EVs的阳性蛋白标志物SYN，而阴性标志物Calnexin则没有信号。这是首次有技术能够在单细胞转录组测序的同时，原位捕获并识别细胞微环境中的细胞外囊泡，为研究细胞间物质交换和信息传递提供了强有力的证据。
其次是模拟的“炎症反应”——对LPS刺激的响应。脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS) 是一种能够模拟细菌感染、诱发炎症和纤维化反应的分子。研究人员在细胞培养的最后4小时加入了LPS。结果，芯片上的细胞社区发生了剧烈的变化。空间分析显示，原本松散分布的细胞开始聚集。转录组数据显示，细胞中与纤维化激活相关的关键标志物，如Bnc2和Sox9的表达显著上调，同时，转化生长因子-β (TGF-β) 信号通路被激活，这是一条经典的驱动纤维化的信号通路。这些数据生动地再现了成纤维细胞在炎症刺激下如何被激活并启动纤维化程序的动态过程。
通过这项巧妙的实验设计，Stereo-cell展示了其超越传统单细胞技术的独特能力。它不再局限于分析离散的单个细胞，而是将视野扩展到了细胞所在的整个微环境。它让我们能够“身临其境”地观察细胞的社交行为，倾听它们与邻居的“交谈”，捕捉它们对环境变化的实时响应。这对于理解癌症微环境、组织修复与再生、以及免疫细胞相互作用等复杂生物学过程，具有不可估量的价值。
在细胞王国里，并非所有成员都是小巧玲珑的。有些细胞，如负责运动的骨骼肌纤维和孕育生命的卵母细胞，是名副其实的“巨兽”。
骨骼肌纤维 (skeletal myofibers)是一个典型的“大家伙”，它由多个细胞融合而成，形成一个含有成百上千个细胞核的合胞体，长度可达数厘米。这种独特的结构让传统的单细胞技术束手无策。即便采用单核测序，也会丢失所有关于不同细胞核在肌纤维内部空间位置的信息。
Stereo-cell的无尺寸限制特性，使其能够轻松捕获并分析整个肌纤维。研究人员从实验小鼠的两种不同类型的肌肉(慢肌（比目鱼肌, soleus）和快肌（趾长伸肌, EDL）)中分离出完整的肌纤维，并将其铺在芯片上。通过对测序数据进行巧妙的区域划分（K-means ROI parcellation），他们得以在亚细胞（或更准确地说是亚纤维）水平上解析转录组的异质性。
结果令人震撼。在EDL肌纤维中，他们发现转录组的表达并非均匀分布，而是呈现出高度区域化的特征。例如，编码肌腱连接处 (myotendinous junction, MTJ) 关键蛋白的基因Col22a1，其表达信号集中在肌纤维的两端；而编码神经肌肉接头 (neuromuscular junction, NMJ) 核心受体的基因Chrna1，则主要分布在肌纤维的中部。利用名为Hotspot的算法，他们甚至识别出了多个在空间上共表达的“基因模块”，这些模块与MTJ或NMJ等特定的功能区域高度相关。这一发现，通过后续的RNAscope原位杂交技术得到了完美的验证，有力地证明了Stereo-cell在解析大型结构内部空间异质性方面的强大能力。
如果说肌纤维是“最长”的细胞结构，那么卵母细胞 (oocyte)则是哺乳动物体内“最大”的单细胞。研究人员从不同周龄的小鼠卵巢中收集了719个卵母细胞，并利用Stereo-cell成功获取了它们的转录组。通过生物信息学分析，他们不仅清晰地将这些卵母细胞划分为了与不同发育成熟阶段（如生长期、GV期、M期）相对应的7个亚群，还构建了它们从不成熟到成熟的完整发育轨迹（伪时间序列分析）。
更令人兴奋的是，在对单个卵母细胞内部进行更高分辨率的分析时，Stereo-cell揭示了RNA分子的亚细胞定位 (subcellular localization) 模式。他们发现了两类空间分布截然不同的基因模块：一类是“聚集模块” (aggregation module)，其代表基因Ooep的RNA分子高度集中在细胞的特定区域；另一类是“分散模块” (dispersion module)，其代表基因Slc45a3的RNA则弥散分布于整个细胞质。这一发现同样得到了单分子荧光原位杂交 (smRNA-FISH) 实验的证实。RNA在细胞内的精确定位对于其功能至关重要，Stereo-cell在这一领域的突破，为研究细胞内部分子机器的组织和调控提供了全新的视角。
从微小的免疫细胞到庞大的肌纤维和卵母细胞，Stereo-cell以其前所未有的包容性和解析力，证明了它是一个真正普适的单细胞分析平台。它不仅能处理常规大小的细胞，更能攻克那些曾被认为是单细胞技术“禁区”的“细胞巨兽”，为我们绘制出这些复杂生命单位内部前所未见的高清转录组地图。
Stereo-cell技术的问世，标志着单细胞生物学研究正从一个主要关注细胞分类和计数的时代，迈向一个更加注重细胞状态、相互作用、空间背景和动态变化的“立体”新纪元。
回顾这项研究，Stereo-cell的突破是全方位的：它通过可扩展的无封装芯片设计，实现了从几百到近百万细胞的超高通量分析，并以极高的保真度重现了真实的细胞群体构成；它为捕捉和鉴定珍贵的稀有细胞群体提供了强大的工具；它打破了组学分析与成像技术的壁垒，实现了转录组、蛋白质组和细胞形态学的多模态整合；最重要的是，它保留了最宝贵的空间信息，让我们能够原位研究培养细胞的微环境、细胞间的社交网络，甚至深入到单个巨型细胞内部，探索亚细胞层面的分子组织规律。
当然，任何一项新兴技术在初期都面临着挑战。Stereo-cell的芯片制造和数据分析流程相对复杂，其开放式设计也对控制潜在的RNA侧向扩散提出了更高的要求，而整个实验流程的自动化水平仍有提升空间。然而，这些挑战恰恰也指明了未来的发展方向。
我们可以预见，随着技术的不断成熟和优化，Stereo-cell及其代表的“空间增强型”单细胞分析理念，将在生命科学和医学的各个领域掀起新的浪潮。在临床上，它可能成为检测外周血中罕见循环肿瘤细胞的利器，为癌症的无创诊断和预后判断带来革命。在发育生物学中，它能够实时追踪胚胎发育过程中细胞命运的决定和组织的形成，绘制出动态的“生命蓝图”。在神经科学中，它将帮助我们解析复杂神经环路中不同神经元类型及其连接的分子基础。
Stereo-cell为我们提供的，不再是一张张离散的细胞“身份证照片”，而是一部关于细胞社会的、高清、彩色、带实时解说的“3D纪录片”。它让我们离那个终极目标：在最真实的环境中，以最全面的维度，理解每一个细胞的生命故事，又迈出了坚实而重要的一步。一个属于单细胞研究的“立体”时代，已经到来。
参考文献
Liao S, Zhou X, Liu C, Liu C, Hao S, Luo H, Hou H, Liu Q, Zhang Z, Xiao L, Xu Y, Huang Y, Zhou S, Li X, Wang Y, Xie L, Zhou Z, Dong S, Wang Y, Xu X, Guo P, Lin X, Lei J, Wang Q, Gong Y, Cheng J, Yuan Z, Yang Y, Huang Z, Li S, Zheng Y, Yang S, Huang X, Liu W, Li M, Deng Z, Yang X, Yin J, Luo Y, Lai Y, Yuan Y, Cheng M, Wang B, Ji J, Esteban MA, Li Y, Gu Y, Ruan Y, Chen L, Wang X, Xie J, Wang J, Liu L, Chen A, Xu X. Stereo-cell: Spatial enhanced-resolution single-cell sequencing with high-density DNA nanoball-patterned arrays. Science. 2025 Aug 21;389(6762):eadr0475. doi: 10.1126/science.adr0475. Epub 2025 Aug 21. PMID: 40839715.
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来源：生物探索一点号1
