摘要：钙离子是细胞内重要的离子信号，调控多种重要的生物过程，如细胞分泌、细胞收缩和运动、细胞增殖和发育、细胞凋亡等。线粒体作为细胞内钙离子稳态的重要调节者，在能量代谢、信号传导、氧化还原平衡等过程中发挥核心作用。线粒体和内质网之间有着密切的联系，它们通过形成线粒体-
钙离子是细胞内重要的离子信号，调控多种重要的生物过程，如细胞分泌、细胞收缩和运动、细胞增殖和发育、细胞凋亡等。线粒体作为细胞内钙离子稳态的重要调节者，在能量代谢、信号传导、氧化还原平衡等过程中发挥核心作用。线粒体和内质网之间有着密切的联系，它们通过形成线粒体-内质网接触点（MERCs）来交换信息和物质。这些接触点对于线粒体钙离子稳态、脂质代谢以及细胞信号传导等过程至关重要。
猪繁殖与呼吸综合征是由PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起猪的一种以繁殖障碍和呼吸道疾病为特征的高度传染性疾病。于没有特效治疗药物和有效的疫苗防治，迄今该疾病仍未取得实质性控制。解析PRRSV增殖的分子机制对于安全高效的新型疫苗设计和抗病毒药物研发具有重要的科学意义。
本研究旨在探讨细胞细胞器在猪生殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）复制中的作用。作者揭示了一种新的PRRSV复制机制，即病毒通过PRRSV GP5、IP3R和VDAC1的相互作用操纵线粒体-内质网接触，诱导Ca2+过度流出到线粒体，导致线粒体功能障碍和mROS的产生。增加的mROS激活自噬，抑制NLRP3炎症小体的激活，从而促进PRRSV复制。
为了研究细胞器在PRRSV复制中的作用，研究人员检测了PRRSV感染后不同细胞器的形态。对GM130（Golgi）、LAMP1（溶酶体）、Tom20（线粒体）和calnexin（ER）的特异性抗体进行免疫荧光分析。随着感染时间的增加，线粒体出现碎片化和聚集，内质网出现凝结（图1A-E）。研究人员进一步分析二者之间的关系，共聚焦结果显示calnexin和Tom20的荧光信号被覆盖，提示PRRSV感染诱导了内质网-线粒体接触（图1F-G）。这些结果表明，PRRSV感染同时改变了线粒体和内质网的形态，并诱导二者接触。
图1 PRRSV感染诱导线粒体和内质网以及ER-线粒体接触的形态学改变。将(A) MARC-145细胞模拟感染或用PRRSV（MOI = 1）感染24 h。(B) MARC-145细胞0-48h(C)(B)中碎片、管状、细长和聚集的定量（n = 30）(D) MARC-145细胞0-48h。(E)(D)中ER小管百分比的定量（n = 30）(F)用PRRSV（MOI = 1）感染MARC-145细胞0-48h(G)对(F)中ER与线粒体共定位的定量分析（n = 30）。
为了探索PRRSV感染如何诱导内质网-线粒体接触，研究人员在MARC-145细胞中过表达PRRSV编码的开放阅读框（ORFs），识别参与线粒体形态改变的蛋白。如图2A-E所示NSP2只能改变线粒体形态而GP5可以同时改变线粒体和内质网的形态。进一步共定位分析发现GP5促进了内质网与线粒体接触（图2F-G）。
图2 PRRSV GP5负责内质网-线粒体的接触。用EGFP、GP5-EGFP或NSP2-EGFP质粒转染(A) MARC-145细胞24 h。采用免疫荧光法检测线粒体（Tom20）的形态。(B)从(A)中获得的线粒体网络数量的定量分析（n = 30）.(C)(A)中碎片、管状、细长和聚集的定量（n = 30）.(D) 用EGFP、GP5-EGFP或NSP2-EGFP质粒转染MARC-145细胞24 h。采用免疫荧光分析法检测ER（calnexin）的形态。比例尺：10µm。(E)定量分析(D)中ER小管的百分比（n = 30）(F) MARC-145细胞与pDsRed2-ER和载体Myc-GP5或NSP2-HA共转染MARC-24h。(G)对(F)中ER与线粒体共定位的定量分析（n = 30）。
内质网和线粒体在Ca2+稳态中起着关键作用。研究人员通过RNA干扰法筛选出GP5促进IP3R通道介导的内质网Ca2+外排到线粒体。免疫荧光分析显示，与对照组细胞相比，GP5-EGFP和IP3R之间的共定位增加（图3）。以上结果表明GP5通过与IP3R相互作用介导内质网 Ca2+外排进入线粒体。
图3 (E)在模拟感染或PRRSV感染的猪肺样本中，通过Co-IP分析来分析GP5与IP3R的相互作用。(F)转染了EGFP-C1和GP5-EGFP的MARC-145细胞，用抗IP3R抗体的免疫染色进行评估（红色）。(G)对(F)中GP5-EGFP与IP3R共定位的定量分析。
电压依赖性阴离子通道（VDAC）是一种位于线粒体外膜的蛋白质，在Ca2+进入线粒体中起着关键作用。共聚焦结果发现无论是PRRSV感染还是GP5-EGFP的表达都能诱导VDAC1结构的聚集，并且该结构与GP5和Tom20共定位（图4H-I）。为了证实IP3R/GP5/VDAC1复合物形成，研究人员进行了接近连接实验（PLA）。与对照组相比，在PRRSV感染过程中，GP5敲低的细胞显示出的VDAC1-IP3R红点数量减少（图4P）。在表达GP5-EGFP的细胞中检测到红点增加（图4Q）。以上结果表明，PRRSV GP5与IP3R和VDAC1相互作用，诱导Ca2+从内质网流出到线粒体。
图4 PRRSV GP5与IP3R和VDAC1相互作用(H)用FLAG-VDAC1转染MARC-145细胞24 (H)通过免疫荧光分析检测FLAG-VDAC1、GP5和线粒体（Tom20）的共定位。(I)将FLAG-VDAC1和EGFP或GP5-EGFP质粒共转染MARC-145细胞24 h。通过免疫荧光分析检测FLAG-VDAC1、GP5-EGFP和Tom20的共定位。(J)采用免疫印迹法分析VDAC1寡聚物和GP5-EGFP。(K)通过免疫印迹分析分析模拟感染或PRRSV感染的猪肺样本中的VDAC1低聚物。(L)通过Co-IP分析GP5与VDAC1的相互作用。(M)在模拟感染或PRRSV感染的猪肺样本中，通过Co-IP分析来分析GP5与VDAC1的相互作用。(N)用PRRSV（MOI = 1）感染sh对照组和shVDAC1 MARC-145细胞24 h后，然后用CCCP（10µM）处理，释放线粒体Ca2+。(P)用PRRSV（MOI = 1）感染sh对照组和shGP5 MARC-145细胞24 h。采用PLA法分析VDAC1与IP3R的相互作用（左图）。右侧显示了每个细胞中VDAC1/IP3R点的相对数量的定量分析。(Q)用载体或GP5-EGFP质粒转染MARC-145细胞24 h。采用PLA法分析VDAC1与IP3R的相互作用（左图）。右侧显示了每个细胞中VDAC1/IP3R点的相对数量的定量分析。
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