摘要：Chen等人提出了一种精确且计算效率高的三维散射模型——多层玻恩(MLB)模型，并用它来重建厚生物样本的三维折射率(RI)。对于重建厚样本的复场这类逆问题，弱散射模型可能会失败或错估折射率，尤其是在折射率对比度较大的情况下。多切片(MS)光束传播方法通过建模多

Chen等人提出了一种精确且计算效率高的三维散射模型——多层玻恩(MLB)模型，并用它来重建厚生物样本的三维折射率(RI)。对于重建厚样本的复场这类逆问题，弱散射模型可能会失败或错估折射率，尤其是在折射率对比度较大的情况下。多切片(MS)光束传播方法通过建模多次散射来提供更真实的重建结果，但MS未能正确考虑高度倾斜的散射，也未能建模反向散射。研究团队提出的MLB模型在许多切片上使用一阶玻恩模型，能够精确捕捉倾斜散射效应并估计反向散射过程，当与反演求解器结合使用时，该模型为高分辨率相位层析成像提供了更准确的折射率重建。该项工作以“Multi-layer Born multiple-scattering model for 3D phase microscopy”为题在Optica上发表。

一般来说，三维相位层析成像方法通过最小化测量值与预期测量值之间的差异来解决一个逆问题，而预期测量值是基于对样品三维复折射率分布的估计计算得出的。迭代算法通过一个正向模型在每次迭代中计算预期测量值，该正向模型描述了光如何通过样品传播。研究团队的多层玻恩(MLB)散射模型通过将三维物体划分为多个薄层，并依次对每一层应用一阶玻恩散射过程，从而包含了多次散射效应，每一层都具有薄但有限的厚度。

图1 MLB正向散射模型是作为三维相位成像框架的一部分进行验证的：使用光学显微镜从不同角度捕获具有空间相干照明的强度测量值，并将这些测量值输入到三维相位层析成像算法中，通过使用MLB散射正向模型解决一个非线性优化问题，实现了对多次散射物体的三维折射率的重建

为了独立于反演求解器分析多层玻恩正向模型的准确性，并与其他用于三维相位成像的散射模型进行比较，首先使用不同方法模拟了一个三维细胞模型的振幅测量值,将其与SEAGLE生成的结果进行比较。细胞模型的折射率对比度确保了多次散射的存在：它包含一个15×15×7.5 µm³的椭球体，其中包含细胞质、细胞核、两个核仁、几个小细胞器以及包裹整个细胞的薄细胞膜。细胞被折射率为n=1.33的介质包围，位于一个分辨率为0.05 µm的450×450×150体素体积内。假设照明波长为532 nm，物镜数值孔径NA=0.8，计算了在轴和离轴照明下，由前向和后向散射光产生的振幅图像。

图 2(a)的顶部行显示了两个不同照明角度下SEAGLE的聚焦振幅，而每种正向模型的误差图在底部四行中展示。由于弱散射近似不适用，一阶玻恩和Rytov方法均产生了较大的误差。相比之下，多切片和MLB散射模型考虑了物体内部的多次散射，大大提高了准确性，然而，在离轴照明下，多切片模型由于采用了傍轴近似，会产生误差。由振幅的前向和后向散射预测而言，MLB是计算效率最高的模型中最准确的。

在使用MLB时，模型的准确性与每层的最大相位之间存在权衡，因为当每层的相位对比度增大时，每个薄层的一阶玻恩近似变得不那么准确。图2(b)通过绘制每层最大相位变化与均方误差(MSE)的演变来说明这种权衡。在前向散射的情况下，MLB结果的MSE随每层的相位线性增长，而Rytov和多切片模型的MSE则相对平稳。当每层的相位小于0.04π时，MLB模型为离轴照明提供了最准确的预测。对于后向散射，由于后向散射光较弱，MSE值较小，但随着每层的相位变化增大，误差迅速增加。同样，当使用更薄的切片时，MLB提供了显著的准确性提升，因为弱散射假设在每层内是有效的。

图2 三维细胞模型的正向模型精度比较。(a)使用一阶玻恩、Rytov、多切片和多层玻恩散射模型的三维细胞模型的正向和后向散射振幅的真实数据（SEAGLE模拟）以及所有其他正向模型的误差图；(b)随每层最大相位增加各模型的精度对比。

为理解正向散射模型的准确性是如何影响三维折射率的重建，研究团队对比了四种不同模型的结果。SEAGLE再次被用于模拟测量值，生成了104张振幅图像，这些图像由源平面上的环形区域照明产生。当物体被接近物镜数值孔径的倾斜光照明时，测量值包含高空间频率成分和丰富的相位对比度，这种情况下，样本的高分辨率三维折射率信息被很好地编码在测量值中，对比结果如图 3所示。

图3 使用一阶玻恩、Rytov、多切片和多层玻恩正向散射模型与反演求解器进行三维折射率重建的模拟比较。

为了在实验条件下量化不同散射模型的准确性，研究团队首先对一个已知样本进行成像——一个直径为5 µm的聚苯乙烯微珠，将其浸入两种不同折射率匹配油中，分别产生折射率对比度。使用了一个40×0.65 NA的物镜，并将物镜的前焦平面与微珠的中心对齐。通过LED阵列显微镜以6.66 帧/秒的速度，从大约23°到44°的入射角度范围内捕获了100张图像。使用四种正向模型进行重建的结果如图4所示。

对于低折射率对比度的情况，样本可以被视为弱散射体，因此所有模型均适用，单次散射模型和多次散射模型的结果相似，注意到在使用LED阵列对弱散射样本进行基于强度的成像时，会出现低信噪比和部分相干效应，这些效应属于模型不匹配，会导致定量不准确，这在将断层重建模型的定量折射率轮廓与理想轮廓进行比较时尤为明显。

在高折射率对比度的情况下，由于多次散射的存在，RI的准确性会因所使用的断层重建框架而显著不同。一阶玻恩近似由于低估了RI值并遗漏了微珠中心的内容而失败，Rytov模型缓解了RI低估的问题，但导致轴向形状失真。MS和MLB重建均考虑了多次散射，但MS重建的微珠呈现拉长的形状，并且定量对比度略低，这与模拟结果相似，使用MLB重建的聚苯乙烯微珠具有更高的定量精度和更各向同性的分辨率，这表明MLB是用于成像高RI对比度和多次散射物体的最佳正向模型。

图4 单个聚苯乙烯微珠在低折射率对比度和高折射率对比度介质中的成像效果。(a)测量的归一化透射振幅的示例；(b)-(c)分别为低对比度和高对比度聚苯乙烯微珠的三维折射率重建的正交切片图，这些重建结果来自不同的散射模型，右侧绘制了沿黑色虚线的1D截面图

接下来，研究团队研究了一个弱散射生物样本——固定化的3T3细胞。图5(a)展示了经过晕影校正后恢复的三维折射率的正交切片图。除了提供样本的定量密度外，三维相位信息在比较三维重建的切片与传统二维相位对比图像时也能提供更好的对比度。图5(c)展示了三种不同成像方式的几个感兴趣区域(ROIs)和深度：非对称半圆形照明的二维相位对比图像、使用四个测量值的差分相位对比(DPC)的定量相位图像，以及恢复的三维RI的一个切片。尽管它们理论上具有相似的焦深，有助于揭示每个平面上的不同结构，但它们的对比度差异显著。在二维相位图像中，焦外信息与焦内细胞内容混合在一起，难以区分。尽管相位对比图像突出了细胞的焦内成分，但仅从相位对比图像中无法解释实际结构。相比之下，三维RI重建自然地在每个深度显示定量光学密度，并构建了高对比度的轮廓，以区分不同的细胞器。

图5 利用MLB散射模型重建3T3细胞的三维折射率。(a)重建的3T3细胞的正交视图；(b)三维渲染图；(c)在(a)中绿色和蓝色框内两个不同深度处，微分相位对比度、定量相位以及3T3细胞三维折射率的一个切片的放大对比。三维切片提供了良好的深度分层和高对比度的定量信息。

MLB模型基于标量波理论描述了目标空间中的多散射过程，且不依赖于成像系统的任何假设。因此，它天然适用于多种不同的显微镜设置，包括LED阵列显微镜。此外，与MS或光束传播方法不同，MLB考虑了非傍轴波的相互作用。

在图6中可以观察到使用第一玻恩模型、MS模型和MLB模型得到的折射率结果存在显著差异。正如预期的那样，由于秀丽隐杆线虫的身体折射率对比度较大且样本较厚，弱散射近似无法捕捉到大部分低频信息。使用MS模型恢复的折射率值略高于MLB模型的结果，这与模拟结果非常一致，此外，图 6中箭头所指的光晕伪影在从MS模型切换到MLB模型时得到了缓解，以上所有结果表明，MLB适用于高NA成像系统和多重散射样本。

图6 利用MLB模型对整个成年雌雄同体秀丽隐杆线虫进行的三维折射率重建

该文介绍了MLB散射模型，它是一种高效、精确的三维相位显微镜正演模型，与广泛使用的单次散射方法相比，MLB模型对多次散射物体具有上级精度和多次散射MS方法的比较，其适度的计算复杂度和高度并行化的操作，与其他多次散射模型相比对于使大规模逆问题可行是重要的。MLB模型不依赖于近轴近似，因此适合于高NA成像，并且还预测后向散射光，从而提高精度，这些进展使3D相位显微术能够应用于一个全新的生物样品范围。

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来源：凯视迈精密测量