摘要：遗传扰动筛选可以通过在细胞中移除随机的基因进行基因型和表型的分析，由此可以破译基因之间的关系。光学干扰筛选通过利用荧光显微镜为遗传扰动筛选提供了广泛的选择。特定的基因扰动可以确定目标基因的生物学功能。通过CRISPR筛选与荧光显微镜相结合可以提供一定的空间分辨
撰文 | 十一月
遗传扰动筛选可以通过在细胞中移除随机的基因进行基因型和表型的分析，由此可以破译基因之间的关系。光学干扰筛选通过利用荧光显微镜为遗传扰动筛选提供了广泛的选择。特定的基因扰动可以确定目标基因的生物学功能。通过CRISPR筛选与荧光显微镜相结合可以提供一定的空间分辨率，然而更为精细的亚细胞结构可能会导致筛选出现结果不一致的情况。
基于原位杂交测序的光学扰动筛选可以对基因功能进行多维度的解析，但是该方法仍然有两个主要的局限。第一，因为测序依赖于细胞质中的mRNA分子，转录活性较低或者体积较小的细胞信号较低，因而排除了在某些细胞类型中的适用性。其次，细胞必须被透性化，才能进行原位杂交实验。
为了解决这些局限，近日，德国波恩大学Jonathan L. Schmid-Burgk研究组在Nature Biotechnology上发表了文章NIS-Seq enables cell-type-agnostic optical perturbation screening，通过开发细胞核原位杂交测序技术NIS-Seq，直接从细胞核基因组DNA中扩展创建明亮的测序信号筛选高密度、高复杂性的基因文库。
基于先前发表的方法【1,2】，作者们开发了NIS-Seq来实现与细胞类型无关的高密度光学CRISPR筛选方法。该方法利用T7体外转录在细胞核中产生多个RNA拷贝，随后通过转录、挂锁延伸、连接以及滚环扩增来增加信号强度，并通过三种激发光以及14个合成测序周期进行测序（图1）。为了检测该方法作者们首先开发了测序兼容的慢病毒载体从而提高基因组编辑效率。该载体配备了一个完整的人类基因组规模的sgRNA文库，可以用于生产慢病毒颗粒。
图1 NIS-Seq工作模型
为了证实NIS-Seq方法在基因组范围内进行筛选的应用，作者们靶向HeLa细胞研究NF-kB激活相关的基因。NF-kB家族中有五个家族成员，能够作为同源二聚体或异源二聚体转录因子发挥作用。在未激活的状态，NF-kB二聚体会通过抑制蛋白比如IkB留在细胞质中；一旦被外源刺激激活，会导致IkK复合体磷酸化从而导致IkB被泛素化以及蛋白酶体降解，从而允许NF-kB二聚体进入细胞核。为了对此过程进行检测，作者们使用包含p65-mNeonGreen报告因子HeLa细胞作为模型进行筛选。作者们使用了两个重复包含76441个sgRNA以及1000个非蛋白靶向的sgRNA作为对照。HeLa细胞被IL-1β以及TNF刺激会通过两种不同的通路激活NF-kB。在活细胞表型分型后，sgRNA的身份会通过NIS-Seq被恢复。作者们发现p65核核转位信号所筛选到基因与已知的下游基因相一致，筛选靶标与已发表的数据是统一的【3】。
在证实该工作方法的稳健性后，作者们将目光集中的在巨噬细胞中炎症小体激活光学筛选之中。NLRP3炎性小体是巨噬细胞中应对病原体相关的分子模式，会导致细胞因子释放以及程序性细胞死亡。使用NIS-Seq，作者们对尼日利亚菌素刺激的THP1单核细胞来源的巨噬细胞进行了全基因组规模的CRISPR敲除筛选，并使用ASC-GFP作为报告因子监测炎症小体在活细胞中组装的早期步骤。由此作者们对巨噬细胞中炎症小体的激活进行解析。
为了进一步地检测NIS-Seq在人类组织中的应用，作者们在人类皮肤上皮细胞层中进行慢病毒文库转染。但这些筛选都是基于已知的表型输出。作者们希望能够建立机器学习模型，通过对HeLa细胞等已有的报告因子细胞图片的分析，能够对未知的科学问题进行光学筛选分析。
总的来说，作者们的工作建立了NIS-Seq光学筛选方法，对8种不同的细胞类型进行了可行性实验分析，确定了炎症相关的细胞通路的关键因子。最后，作者们在人类组织中进行了小规模的实验，可以利用慢病毒转导实现光学筛选。该研究为光学扰动筛选提供了更为优化的实验方法。
制版人：十一
参考文献
1. Feldman, D. et al. Optical pooled screens in human cells.Cell179,787–799 (2019)
2. Askary, A. et al. In situ readout of DNA barcodes and single base edits facilitated by in vitro transcription.Nat. Biotechnol.38, 66–75 (2020).
3. Feldman, D. et al. Optical pooled screens in human cells.Cell179, 787–799 (2019)
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来源：乱九