摘要：一、背景：当“剪接”遇上“转录”真核基因表达似乎遵循一条线性流程：DNA→pre-mRNA→剪接→mature mRNA→蛋白质。然而，活细胞成像与新生 RNA 测序反复证实，大多数内含子在 RNA 聚合酶 II（Pol II）尚未到达转录终点时已被移除，即“
一、背景：当“剪接”遇上“转录”
真核基因表达似乎遵循一条线性流程：DNA→pre-mRNA→剪接→mature mRNA→蛋白质。然而，活细胞成像与新生 RNA 测序反复证实，大多数内含子在 RNA 聚合酶 II（Pol II）尚未到达转录终点时已被移除，即“共转录剪接”（co-transcriptional splicing, CTS）。CTS 要求剪接机器在极短的时间窗内完成识别-校验-催化，且不能与转录“撞车”。过去四十年，领域默认 Pol II 的 C 端结构域（CTD）是招募剪接因子的“平台”，而 U2 辅助因子（U2AF）一旦结合 3' 剪接位点（3'ss）便进入“等待”状态。西湖大学付向东团队最新发表于《Science》的研究，通过揭示“动态 U2AF 循环”，首次把 CTS 拆分为“Pol II 依赖识别”与“Pol II 非依赖组装”两阶段，并证明 CTD 并非必需，为经典模型打上补丁。
二、关键分子名片
U2AF：由大亚基 U2AF2（识别多嘧啶束 PPT）与小亚基 U2AF1（识别 3'ss AG）组成，是早期剪接体招募的“门户”。RPB9：Pol II 的第九大亚基，曾被视为“延伸保真度”调节因子，无已知剪接功能。CTD：Pol II 最大亚基 RPB1 的 C 端尾巴，含 52 段七肽重复（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser），其磷酸化密码被认作转录-剪接耦合的“键盘”。三、研究路线速览
发现交互：酵母双杂交 + 交联质谱锁定 RPB9–U2AF1 直接互作面。动态成像：CRISPR 敲入 HaloTag-U2AF1 与 SNAP-U2AF2，联合快速光片显微镜 + FRAP，量化“装载-释放”半衰期。功能干扰：氨基酸突变、小分子干扰肽、CTD 截短细胞系，测定剪接效率。转录组：染色质相关 RNA 测序（chrRNA-seq）+ 长读长纳米孔测序，量化两阶段转换。疾病验证：U2AF1-S34F 白血病突变体与急性髓系白血病（AML）细胞模型，测试“循环失衡”导致外显子跳跃。四、结果拆解
RPB9 直接“递送”U2AF1 至新生 3'ss体外 pull-down 显示，U2AF1 锌指 1（ZF1）与 RPB9 β-折叠-2 形成疏水界面，突变任一接触面（U2AF1-F42D 或 RPB9-V70R）即可阻断互作。交联质谱在活体细胞捕获 42 条跨复合物肽段，证实该接触发生在转录泡内。U2AF2 以浓度依赖方式“接管”U2AF1
荧光漂白实验显示，U2AF1 在转录位点的停留时间 τ≈6.3 s；当诱导 U2AF2 核浓度升高 2 倍，τ 缩短至 2.1 s，提示 U2AF2 竞争取代 RPB9，形成经典异二聚体。数学模拟表明，U2AF2 浓度在 80–400 nM 范围内可确保“识别-组装”无缝切换，与 HeLa 实测值（≈220 nM）吻合，赋予细胞“自我校准”能力。两阶段模型
阶段 I（Pol II 依赖识别）：RPB9–U2AF1 结合 nascent RNA，扫描并锁定 3'ss AG；此时 U2 snRNP 尚未招募。
阶段 II（Pol II 非依赖组装）：U2AF2 取代 RPB9，与 U2AF1 形成稳定平台，招募 U2/U6 snRNPs，完成剪接体组装与催化。
chrRNA-seq 显示，阶段 I 平均持续 5–8 s，阶段 II 持续 10–15 s；若 RPB9 缺失，阶段 I 延长 3 倍，下游外显子剪接效率下降 40%，但 5'ss 使用不受影响，提示功能特异性。CTD 结构域非必需
利用 Rpb1-CTD52→10 或 Ser2/5Ala 突变细胞，作者发现 3'ss 识别效率仅下降 疾病场景：U2AF1 突变导致循环失衡
白血病热点突变 U2AF1-S34F 增强与 RPB9 的亲和力 1.8 倍，使阶段 I 过度延长，下游外显子被过早剪接，产生 22% 外显子跳跃。用小分子干扰肽 DP-9-1（源自 RPB9 β-折叠界面）可阻断异常互作，恢复 35% 正常剪接事件，为“合成致死”策略提供概念验证。
五、技术革新
毫秒级荧光捕获自制 488 nm 光片显微镜，曝光 5 ms，配合温度敏感延伸突变（rpb1-E1123K）把 Pol II 速率降至 0.8 kb min⁻¹，首次在活体细胞解析秒级 RBP 交换。交联-质谱-建模三联
DSSO 交联肽段输入 Rosetta 获得低能构象，再与 3.4 Å cryo-EM 结构（PDB 7C03）对接，精度达 2.1 Å，实现“活体接触面”原子级定位。长读长方向性 chrRNA-seq
低盐+洋地黄皂苷保留 nascent RNA，4sU 标记富集，纳米孔直接 RNA 测序获得 5'→3' 方向性，量化内含子移除率，避免 cDNA 扩增偏差。
六、理论更新与领域冲击
“CTD 键盘”模型被部分修正早期研究把 CTD 磷酸化视作剪接因子招募“唯一入口”。本文证明，在基础/组成型 CTS 中，RPB9 足以完成“递送”任务，CTD 更多扮演“放大器”或“整合器”角色。U2AF 功能再定义
U2AF 不再是“静态门户”，而是“动态循环体”。其交换速率受 U2AF2 浓度、RPB9 亲和力和 RNA 二级结构共同调节，为“剪接-转录节拍耦合”提供量化框架。疾病机制外延
U2AF1 突变不仅导致血液病，也在部分实体瘤中检出。动态循环失衡可能是“剪接病”共通机制，拓展了“肿瘤-剪接”研究视野。
七、未来 5 年值得攻关的 5 个问题
单分子验证利用 DNA 纳米折纸把 3'ss 固定在指定空间，实时观察 U2AF1/2 交换动力学，验证“浓度阈值”模型。磷酸化调控
RPB9 是否存在 CDK7/12 磷酸化位点？磷酸化如何调节其与 U2AF1 亲和力？相分离视角
高浓度 U2AF2 是否通过液-液相分离（LLPS）加速 U2AF1 释放？核斑体如何与 CTS 时空耦合？非 3'ss 功能
RPB9-U2AF1 是否参与多腺苷酸位点选择、RNA 出核？药物优化
DP-9-1 细胞渗透性有限，需开发环肽、PROTAC 或分子胶版本，预计 2026 年提交 IND。
八、结语：从“静态快照”到“分子电影”
这项研究把 CTS 从“黑箱”变为“两幕剧”：RPB9 递送、U2AF2 接管，节拍精确到秒。它不仅解答了“U2AF 如何及时找到尚未出生的 3'ss”这一经典难题，也为“剪接病”提供可成药界面。正如审稿人所述：“作者让 U2AF 跳起了细胞内的‘交换舞’，我们终于可以看清每一步脚印。” 下一步，让这场舞蹈在病理状态下放慢或加速，或许就是新药干预的最佳时机。
来源：医学顾事