CRISPR文库筛选技术应用指南「第二章」：CRISPR文库的分类与选择

摘要：A.全基因组文库覆盖所有基因，适合探索未知领域；目前文库在设计的时候为了保证充分的覆盖，会分布针对基因组的所有基因独立设计两套sgRNA的集成，所以基因组文库有时候会有A库和B库，本质只是设计的sgRNA的序列不同，可以作为相互的参照，也可一起联合使用。

1. 按筛选范围分类

（1）全基因组文库 vs. 亚文库

A. 全基因组文库覆盖所有基因，适合探索未知领域；目前文库在设计的时候为了保证充分的覆盖，会分布针对基因组的所有基因独立设计两套sgRNA的集成，所以基因组文库有时候会有A库和B库，本质只是设计的sgRNA的序列不同，可以作为相互的参照，也可一起联合使用。

B. 亚文库聚焦特定基因，适合已有假设的研究（Hart et al., 2017, G3: Genes, Genomes, Genetics）。亚文库或子文库指某一类基因的组合，比如某个基因家族、某个信号通路等。目前已构建好的现货文库有很多，如人/小鼠/绿猴的全基因组文库，激酶、核蛋白、细胞周期蛋白、代谢相关蛋白和表观遗传相关蛋白亚文库，都可以在海星Cas9X获得。

C.个性化定制文库，可以依据研究者关注的基因，从几个到数百个等都可以按照研究的需要独立设计构建起个性化的文库。

（2）现货文库 vs. 定制文库

现货文库经济省时，可以通过转染而快速扩增起来，所以比较便宜、交付快，适合常规实验。海星Cas9X可以提供基本所有的覆盖全基因组和主要研究使用的现货文库，也可以快速从Addgene和其他实验室通过合作活动现货文库，可以快速加快文库的研究部署。

定制文库灵活，但涵盖整个合成过程，所以成本高，但是更加准确适合具体的研究（Doench et al., 2018, Nature Reviews Genetics）。目前可以海星Cas9X构建从1K到92K的宽范围的文库，完美匹配任何研究的需求，文库的构建使用的芯片合成、扩增、测序，整个过程需要3-4周时间。

2. 按筛选要求分类

(1) 敲除 vs. 激活/抑制

敲除文库研究基因缺失的影响，激活/抑制文库研究表达变化的效应（Gilbert et al., 2014, Cell）。一个是直接剥夺基因功能，一个是对基因的表达进行上调和下调，以研究不同状态下的基因功能。

(2) 单细胞筛选 vs. 多细胞筛选

单细胞筛选细化到个体细胞水平，特别适合研究复杂疾病（如肿瘤异质性），核心是将CRISPR文库的基因扰动与单细胞转录组数据关联起来；将传统群体水平分析细化到单个细胞。它结合CRISPR文库的高通量基因编辑和单细胞RNA测序（scRNA-seq），能一次性研究数千细胞中每个细胞的基因功能和表达变化。例如，2024年，Yan等人用单细胞筛选优化CAR-NK疗法，发现增强抗肿瘤活性的基因（Yan et al., 2024, Nature Biotechnology）。单细胞的文库一般要求每个sgRNA需覆盖数百个细胞（如500-1000倍），确保统计意义。

CRISPR文库结合单细胞技术使用

多细胞筛选适用于研究细胞群体水平的功能（Doench et al., 2018, Nature Reviews Genetics）是目前使用最多的文库筛选方式。

海星生物依托自主研发的CRISPRSeek™文库筛选平台与算法平台，可以提供 CRISPR-KO、CRISPRa （激活）和 CRISPRi（抑制）三大定制文库筛选服务，技术流程覆盖sgRNA设计、病毒包装、细胞转染、高通量测序及数据深度分析全流程，助力基因功能研究与药物靶点筛选。我们以高效、精准、智能的技术平台，满足多样化科研需求。