陈学思院士、孙静教授AM：新型pH响应纳米囊泡，精准对抗耐药菌与生物膜

摘要：近年来，抗生素耐药性已成为全球公共卫生领域的重大挑战。其中，多重耐药金黄色葡萄球菌（MDR S. aureus）被世界卫生组织列为重点防控的二级病原体，其对多种一线抗生素（如甲氧西林和万古霉素）的耐药性日益增强，使得传统治疗方法效果有限。细菌生物膜的形成进一步

近年来，抗生素耐药性已成为全球公共卫生领域的重大挑战。其中，多重耐药金黄色葡萄球菌（MDR S. aureus）被世界卫生组织列为重点防控的二级病原体，其对多种一线抗生素（如甲氧西林和万古霉素）的耐药性日益增强，使得传统治疗方法效果有限。细菌生物膜的形成进一步增加了治疗难度，亟需开发新型协同抗菌策略以应对这一威胁。

为此，吉林大学孙静教授、中国科学院长春应用化学研究所陈学思院士合作成功开发出一种名为DACILy的pH响应型抗菌纳米囊泡，该体系通过整合靶向配体与多种抗菌剂，实现了对耐药菌的高效精准治疗。DACILy由带硫离子的抗菌聚肽类似物（PNSG-O-Cl）和经2,3-二甲基马来酸酐修饰的含氨基聚肽类似物（PNAG-DA）复合而成，并封装了溶葡萄球菌酶（Ly）。在感染部位的酸性微环境中，纳米囊泡解离并释放抗菌成分，通过酶解细胞壁和破坏细胞膜的双重机制，显著增强了对MDR S. aureus及其生物膜的杀菌效果。相关论文以“Targeted Cascade Therapy with Multifunctional Nanovesicles Engineered from Synergistic Antibacterial Agents for Precision Treatment of Multidrug-Resistant Infections and Biofilms”为题，发表在Advanced Materials上，论文第一作者为Gong Yiyu。

示意图1. A) 靶向微环境响应型抗菌聚肽类似物纳米囊泡（DACILy）的构建示意图； B) 其抗菌作用模式示意图。

研究中，团队首先筛选出具有协同抗菌效应的聚合物与Ly（图1）。棋盘法实验显示，PNSG-O-Cl与PNAG-NH₂联合Ly对多种S. aureus菌株表现出强烈协同作用，最低FIC指数低至0.188。进一步通过TEM观察证实，联合处理可引起细菌细胞壁破损和膜结构严重变形，表明Ly酶解作用增强了聚合物对细胞膜的攻击。

图1. 聚合物与Ly的协同抗菌效应。A) Ly与多种聚肽类似物对不同S. aureus和MDR S. aureus菌株的FIC指数；B–E) 对不同S. aureus菌株进行的棋盘稀释试验，评估Ly与聚合物之间的协同作用。

随后，研究人员构建了靶向微环境响应型纳米囊泡DACI（图2）。该囊泡在生理pH下保持稳定，在pH 5.5时发生解离并释放Ly，其zeta电位由负转正，显著增强与细菌的结合能力。共聚焦显微镜图像显示，FITC标记的DACI能特异性富集于细菌表面，而非哺乳细胞，证明其良好的靶向性。

图2. 靶向微环境响应型抗菌聚肽类似物纳米囊泡的表征。A) DACI的负染色TEM图像；B) DACI的AFM图像；C) DACILy的负染色TEM图像；D) DACILy的AFM图像；E) FITC标记的DACI与NR共染S. aureus USA300-R的CLSM图像；F) FITC标记的DACI与HUVEC和S. aureus共培养的CLSM图像；G) DACI在不同pH下的zeta电位；H) SACI在不同pH下的zeta电位；I) DACILy在不同pH下Ly的累积释放率；J) SACILy在不同pH下Ly的累积释放率；K–N) DACI和SACI在pH 7.4和5.5下的负染色TEM图像。

在体外抗菌实验中（图3），DACILy在pH 5.5条件下对多种S. aureus菌株表现出极强的杀菌能力，细菌存活率降至0.3%，远优于单一组分或其他对照组。活死细胞染色进一步显示，DACILy处理组中红色荧光（死菌）显著增强，表明其能有效破坏细菌膜结构。

图3. 体外抗菌活性。A) 囊泡在不同pH下对S. aureus和耐药菌的杀菌 assay；B) 在pH 5.5下经不同处理后的S. aureus USA300-R的Live/Dead染色CLSM图像。

针对生物膜的研究表明（图4），DACILy在预防和清除成熟生物膜方面均表现卓越，杀菌率高达99.9%。CLSM图像显示，经DACILy处理的生物膜中几乎无活菌存在，显著优于其他处理组。

图4. 对MDR S. aureus生物膜的活性。A) 预防生物膜形成的能力；B) 清除成熟生物膜的能力；C) 抑制生物膜形成的CLSM图像；D) 破坏成熟生物膜的CLSM图像。

抗菌机制深入研究（图5）通过膜电位去极化、膜通透性试验和细胞内容物泄漏检测，证实DACILy能显著增强膜破坏作用。SEM和TEM图像进一步显示，经DACILy处理的细菌出现膜结构严重破损和胞质空洞化，说明其通过协同作用实现了高效杀菌。

图5. 抗菌机制研究。A) 膜 depolarization 检测；B) 膜通透性检测；C) 260 nm处吸光度检测胞内容物泄漏；D) SEM图像显示细菌形态变化；E) TEM图像显示超微结构变化。

在生物安全性方面，DACILy表现出较低的细胞毒性和溶血性，HUVEC细胞存活率达76.3%，且在高浓度下仍无明显溶血现象，显示出良好的生物相容性。在小鼠皮肤伤口感染模型中（图6），DACILy治疗组细菌载量下降98.6%，伤口愈合速率达89.8%，组织切片显示炎症细胞浸润减少，胶原和新生血管增多，病理评分最低。

图6. 小鼠皮肤伤口感染模型中的抗菌效果。A) 实验流程示意图；B) 治疗后细菌抑制率；C) 伤口愈合过程照片；D) 伤口大小变化统计；E) 治疗后第7天组织H&E染色切片。

在肺部感染治疗中（图7–8），DACILy通过雾化给药有效穿透黏液层，并在肺部滞留长达三天。治疗组肺部细菌载量下降99.1%，炎症因子（IFN-β、IL-6、IL-17A）水平显著降低，同时肺组织修复蛋白（SP-C、VEGF-A、α-SMA）表达上升，表明其不仅能高效杀菌，还能促进组织修复与抗炎反应。