摘要：近年来，环肽类化合物因其高亲和性、良好的代谢稳定性以及靶向传统“不可成药”靶点的能力，成为药物研发中的重要研究对象。噬菌体展示作为一种便捷的技术，被视为筛选肽类苗头化合物的理想平台，不过，展示区的环肽高效构建和功能筛选目前仍面临巨大挑战。化学成环策略往往反应条
近年来，环肽类化合物因其高亲和性、良好的代谢稳定性以及靶向传统“不可成药”靶点的能力，成为药物研发中的重要研究对象。噬菌体展示作为一种便捷的技术，被视为筛选肽类苗头化合物的理想平台，不过，展示区的环肽高效构建和功能筛选目前仍面临巨大挑战。化学成环策略往往反应条件剧烈，且可能与衣壳蛋白存在交叉反应，易破坏噬菌体感染活性，不太容易直接与噬菌体展示技术相结合。酶促环化虽反应条件温和，但已知环化酶对底物序列有严格要求，操作复杂且开发难度大。因此，开发一种兼具反应操作简易、生物相容性高、底物适用性广以及位点选择性精确等优势的环化策略，已成为环肽药物发现领域的迫切需求。
兰州大学雷新响课题组近年来致力于针对潜在药用靶点发掘活性环肽抑制剂的研究，在噬菌体多肽展示筛选领域开展了相关的探索工作。成功地将邻苯二甲醛与异硫氰酸酯主导的成环策略应用到噬菌体展示平台上（New. J. Chem.2022, 46, 10299; Chem. Sci.2024, 15, 11847; ChemRxiv. 2024, DOI: 10.26434/chemrxiv-2024 zh6t7）。近日，该课题组以酪氨酸酶（Tyrosinase）为生物催化剂、展示于噬菌体pIII蛋白的含酪氨酸/半胱氨酸基序的线性肽为底物，通过一步酶促环化反应，成功在噬菌体表面构建了高稳定性、高多样性的大环肽库，并针对多个疾病相关靶点筛选出具有抑制活性的环肽分子。研究发现，酪氨酸酶在噬菌体环境中仍能保持高效催化活性，并仅特异性识别外源肽链中的酪氨酸，且不作用于病毒衣壳内部天然酪氨酸，显示出优异的生物兼容性与空间选择性。通过该酶催化策略，该课题组实现了在生物环境中一步酶学定点“分子纽扣”构建多样性环肽库，为环肽药物的发现提供了强大的展示平台（图1）。
图1. 酪氨酸酶介导的成环反应用于噬菌体环肽文库的构建
研究首先通过模型肽验证了酪氨酸酶在不同pH（5.0–9.0）条件下的环化能力，LC-MS与质谱分析表明酶在各种生理缓冲液中都具高催化活性。而模型肽在pIII蛋白上的成功成环证实该酶与噬菌体环境的良好兼容性。随后，作者构建了高容量的线性肽噬菌体库（AYX库），经酪氨酸酶处理并经生物素-链霉亲和素下拉实验评估，显示在酶浓度 ≥ 0.6 µM时环化效率达87%，而未处理组几乎无信号。关键的是，噬菌体滴度实验表明该酶促反应不影响病毒感染性，在2 µM酶浓度下孵育30分钟仍保持完整活力。
图2. 酪氨酸酶催化的噬菌体展示肽的成环并展现良好的生物相容性。
为阐明酶的空间选择性，该课题组设计了一系列在pIII蛋白展示区含不同数目外源酪氨酸的噬菌体突变体，经酪氨酸酶处理后进行了精确的质量分析。结果显示，酶促反应导致的分子量增加与外源酪氨酸的数量严格呈正相关：每多一个可被催化氧化的酪氨酸，其分子量增加幅度与理论计算一致（符合醌-半胱氨酸加成产物的预期增重），而野生型pIII蛋白（不含外源酪氨酸）则未检测到明显的质量变化。这一结果直接证明，酪氨酸酶仅作用于外源引入的、高可及性的酪氨酸，而不识别pIII蛋白自身结构中原有的酪氨酸残基，排除了非特异性修饰的可能。同时，共聚焦显微镜分析显示，野生型噬菌体样本中观测不到绿色荧光信号，而突变噬菌体则形成明显的聚集荧光斑点，直观证实了酪氨酸酶的选择性催化活性仅发生于外源展示肽区域。
图3. 酪氨酸酶作用下，偶联的Cys与外源Tyr的数量是相对应的。
在验证环化平台可行性的基础上，作者针对磷脂酰肌醇-5-磷酸4-激酶2α（PIP4K2A）、蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）和NIMA相关激酶7（NEK7）等多个治疗相关靶点开展了亲和筛选。高通量测序与结合实验表明，从环肽库中富集得到的多株克隆具有高亲和力，其中环肽ACI1对PIP4K2A的Kd为0.46 µM，IC50达0.93 µM；环肽ACP1对PTP1B的Kd为0.72 µM，IC50为1.06 µM，且其线性前体活性显著下降，凸显环化对提升结合与抑制能力的关键作用。
图4. 酪氨酸酶催化策略在大环肽抑制剂发现中的应用。
综上所述，兰州大学雷新响教授课题组开发了一种酪氨酸酶介导的噬菌体展示环肽平台，实现了在噬菌体表面高效、高选择性环肽库的构建，并成功应用于多个疾病相关靶点的活性环肽筛选。该策略不仅克服了传统化学环化生物相容性差的瓶颈，也规避了现有酶促环化严格的底物序列限制，为环肽类药物的开发提供了强大、通用且易于推广的新方法。此外，该工作也为酶催化合成与生物展示技术的结合提供了重要范例，有望推进环肽先导化合物或PDC药物发现及核药导航亲和分子的高效开发。
Exploring Phage Peptide Scaffolds: Tyrosinase-Mediated Cyclization for Selective Generation of Bioactive Cyclic Peptides
Li-Wen Bai, Peng Cheng, Ting Dan, Hua Xiang, Xiao-Qin Yang, Yi-Fei Chen, Shu-Sen Li, Zheng-Hui Li, Jin-Ming Gao, Xinxiang Lei*
J. Am. Chem. Soc. 2025, DOI: 10.1021/jacs.5c12291
来源：X一MOL资讯
