摘要：固定与封片‌：固定样本（如4%多聚甲醛），使用抗荧光淬灭封片剂（如DABCO或商品化封片剂），避免荧光信号衰减。

使用荧光显微镜观察绿色荧光（如FITC、GFP等）需要特定的配置和操作步骤。以下是详细的步骤和注意事项：

1.样本制备‌

荧光标记‌：样本需用绿色荧光标记物处理（如FITC标记的抗体、GFP转染的细胞等）。

固定与封片‌：固定样本（如4%多聚甲醛），使用抗荧光淬灭封片剂（如DABCO或商品化封片剂），避免荧光信号衰减。

避光保存‌：制备后的样本避光保存，防止光漂白。

2.显微镜配置‌

光源‌：汞灯或LED光源（需支持蓝光激发，如波长450-490 nm）。

滤光片组‌：

激发滤光片：选择470-495 nm波段（针对FITC/GFP的激发峰）。

发射滤光片：选择510-550 nm波段（捕获绿色荧光信号）。

二向色镜：反射蓝光并透射绿光（如分光镜型号匹配FITC/GFP）。

物镜‌：高数值孔径（NA≥1.2）油镜（60×或100×），提升分辨率和信号强度。

3.操作步骤‌

开启光源‌：预热汞灯（约15分钟）或打开LED光源。

放置样本‌：将玻片固定于载物台，滴浸镜油（油镜使用）。

选择滤光片组‌：切换到绿色荧光对应的滤光片组（如FITC/GFP通道）。

调焦‌：

先用低倍物镜（如10×）找到样本位置。

切换至高倍油镜，微调焦距至细胞结构清晰。

调节光强‌：降低光源强度或缩短曝光时间，避免荧光淬灭。

图像采集‌：使用CCD相机或软件捕获图像，调节增益和对比度优化信号。

4.注意事项‌

避免光漂白‌：减少样本暴露时间，使用抗淬灭剂。

排除自发荧光‌：未标记的样本作为对照，区分非特异性信号。

多色实验‌：若同时标记其他荧光（如红色），需切换滤光片组避免串色。

维护设备‌：定期清洁物镜和滤光片，校准光源强度。

5.常见问题‌

信号弱‌：检查抗体浓度、光源老化或滤光片匹配性。

背景高‌：优化封闭步骤（如用BSA或血清），减少非特异性结合。

成像模糊‌：确认浸镜油无气泡，物镜清洁。

通过以上步骤，可清晰观察绿色荧光标记的样本。若需更高分辨率或三维成像，可考虑共聚焦显微镜或超分辨显微技术。

来源：科技星辰琼海