摘要：引用格式：刘红宾, 吕青青, 戴磊. (2020). 小鼠粪便样本中16S拷贝数的定量检测. // 微生物组实验手册.Bio-101: e2003368. DOI:10.21769/BioProtoc.2003368.
小鼠粪便样本中16S拷贝数的定量检测
Quantitative Analysis of 16S rRNA Gene Copies in Mouse Fecal Sample
刘红宾1 *11. 中国科学院深圳先进技术研究院，深圳，广东省
*通讯作者邮箱：binhongliu@126.com
引用格式：刘红宾, 吕青青, 戴磊. (2020). 小鼠粪便样本中16S拷贝数的定量检测. // 微生物组实验手册.Bio-101: e2003368. DOI:10.21769/BioProtoc.2003368.
How to cite: Yunyun Gao, Kai Peng, Defeng Bai, et al. 2024. The Microbiome Protocols eBook initiative: Building a bridge to microbiome research. iMeta 3: e182.
摘要：16S rRNA基因和宏基因组测序技术是研究肠道菌群结构与功能的重要手段，由此可以获取微生物群落的结构和功能组成信息；然而，二者得到的数据均为相对丰度类型，大大削弱了不同样品间的可比性，也难以揭示生物量水平的菌群结构和功能变化。本文旨在运用实时荧光定量PCR技术（Real-time PCR）技术对小鼠粪便中的16S rRNA基因进行定量检测，为准确分析肠道菌群的结构提供技术参考。
关键词：16S rRNA基因，绝对定量，肠道菌群
试剂：
1.高保真酶（PrimeSTAR，TAKARA，R045A）
2.TB Green酶（TAKARA，RR820A）
3.Omega胶回收试剂盒（Omega，D2500-01）
4.琼脂糖
5.引物（27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1541R-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA ；331F-TCCTACGGGAGGCAGCAGT，797R-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT）[1]
仪器设备
1.Nanodrop 2000
2.电泳仪
3.普通PCR仪（Bio-read）
4.荧光定量PCR仪（Bio-read）
1.全长16S rRNA基因扩增
PCR扩增体系：
试剂浓度体积 （μl）PrimerSTAR-2527F2 μM51541R2 μM5小鼠粪便DNA60-80 ng/μl1ddH2 O14PCR扩增程序（30个循环）：
98 °C5 min98 °C10 s55 °C15 s72 °C15 s12 °C∞2.全长16S rRNA基因扩增产物回收
按照胶回收试剂盒说明书，对PCR扩增产物进行回收，并利用Nanodrop对其浓度进行测定。
3.全长16S rRNA基因扩增产物拷贝数确定
举例：Nanodrop测得胶回收的16S片段的浓度为182 ng/μl，由于1,500 bp的16S核酸的分子量为5.1 x 105 ng/nmol（https://www.genscript.com/conversion.html），所以标准品中含有3.57 x 10-4 nmol分子，根据阿伏伽德罗常数计算1 μl标准品中含有2.14 x 1011 个拷贝。4.全长16S rRNA基因扩增产物梯度稀释
将标准品做10倍系列稀释, 使其形成109 -104 拷贝/μl。
B.16S rRNA基因拷贝数标准曲线的制备
1.全长16S rRNA基因梯度拷贝数标准品的定量PCR检测
Real-time PCR扩增体系：
试剂浓度体积 （μl）TB Green 酶-10331F4 μM1797R4 μM1全长16S rRNA 基因DNA标准品梯度浓度1ddH2 O7PCR扩增程序（40个循环）：
98 °C3 min98 °C5 s55 °C30 s+ Plant Read72 °C30 sMelt curve 65 °C to 95 °C, increment 0.5 °Cfor 0:05 + Plate Read12 °C∞2.构建16S rRNA基因梯度拷贝数标准曲线
以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标, 以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标得到标准曲线, 为待测样品的定量提供了定量检测的参照标准.
C.小鼠粪便DNA待测样品中16S rRNA基因拷贝数的定量检测
对小鼠粪便DNA待测样品，按照“全长16S rRNA基因梯度拷贝数标准品的定量PCR检测”中的程序与条件，进行real-time PCR检测。依据建立的标准曲线，计算出待测样品中的16S rRNA基因拷贝数。
下图1 展示了溶解曲线、标准曲线和待测样品的检测结果。依据标准曲线方程，Ct值为8的小鼠粪便DNA样品中含有的16S rRNA基因拷贝数为10^（-0.2819 x 8 + 10.682）= 2.67 × 108 个。
图1. RT-PCR方法检测粪便样本中微生物16S rRNA基因拷贝数熔解曲线和标准曲线
1.Jian, C., Luukkonen, P., Yki-Jarvinen, H., Salonen, A. and Korpela, K. (2020). Quantitative PCR provides a simple and accessible method for quantitative microbiota profiling.PLoS One 15(1): e0227285.
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来源：微生物组