摘要：今天推荐的是由加拿大温莎大学化学和生物化学系在2022年5月14日发表于Biomolecules（2021IF：6.0644，JCRQ1）的一篇综述，通讯研究人员是Yufeng Tong教授，综述主要阐述了关于去泛素酶的研究——使用正确的工具来完成工作。

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今天推荐的是由加拿大温莎大学化学和生物化学系在2022年5月14日发表于Biomolecules（2021IF：6.0644，JCRQ1）的一篇综述，通讯研究人员是Yufeng Tong教授，综述主要阐述了关于去泛素酶的研究——使用正确的工具来完成工作。

研究背景

近年来，去泛素酶（DUBs）一直是人们密切关注的对象。它们的许多不同的酶学机制在体外得到了很好的表征；然而，由于缺乏高质量的工具试剂，研究人员对这些酶在细胞水平上的理解滞后。DUBs似乎在每一个生物过程中都发挥着作用，是许多人类病症的核心，因此使它们成为非常理想和具有挑战性的治疗目标。

摘要部分

本综述旨在为进入泛素化领域的研究人员提供有关研究DUBs的药理调节剂和工具分子的知识。重点是小分子抑制剂、泛素变体（UbVs）和基于活性的探针（ABPs）。UbV技术是一种有前途的方法，可以迅速扩大已知的DUB抑制剂库，并可作为结构导向药物设计的组合平台。

研究内容

1.去泛素化酶：分类和活性调节

现在人们都知道，泛素化是一种受到严格调控的、高度特异的翻译后修饰（PTM），参与了似乎所有的生物过程。蛋白体靶向降解是这种修饰的典型作用，但无数的研究已经揭示了它对信号转导、贩运、基因表达和其他细胞过程的关键性。

由于Ub本身可以在其七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）中的任何一个以及其N端（M1）被泛素化，Ub还可以通过磷酸化进行翻译后修饰，研究人员能够利用Ub机制的书写者、阅读者和擦除者，在抗击癌症、衰老相关疾病、智力障碍等方面进行新型治疗。

去泛素化被去泛素酶（DUBs）的活性所逆转。已知的DUBs被分为七个主要家族：USP（泛素特异性蛋白酶）、UCH（泛素C端水解酶）、OTU（卵巢肿瘤）、MJD（含Machado-Joseph结构域的蛋白酶）、MINDY（与含Ub的新型DUB家族相互作用的动机）、和ZUFSP（具有UFM1特异性肽酶域蛋白的锌指）家族以及JAMM（JAB1/MPN/MOV34域相关）家族的Zn依赖性金属蛋白酶。USP家族是最大的，有58个成员。每个家族的成员都是通过结构上同源的催化结构域联系在一起的，但由于存在插入、缺失和具有不同功能的附加结构域，因此可以有很大的不同。

DUBs通过处理Ub前体（UBC、UBB、UBA52和UBA80）和未结合的链；在蛋白酶体上回收Ub；以及对各种目标进行去泛素化，对于维持Ub的平衡至关重要。此外，它们还充当高度复杂代码的解释者和编辑者。E3-DUB复合物是常见的，它把共轭和解共轭结合起来，以促进链的编辑和分子输出的微调。在A20（一个OTU家族成员）这种罕见的情况下，E3和DUB活动都被编码到一个单一的多功能酶中。

决定DUB活性和底物特异性的因素包括催化域的结构、底物招募或Ub结合的附加域的存在、替代剪接、异构化、寡聚化、PTMs和亚细胞定位。重要的是，并非所有的DUB都具有催化活性。大约10%是假酶，目前在USP、OTU、JAMM和MINDY家族中发现。伪DUBs是大型大分子复合物的关键成分，或作为活性DUBs的异生调节剂。最有名的是PSMD7，一个假DUB，与活性DUBPSMD14二聚。这种复合物是19S蛋白酶体调节颗粒的一个重要组成部分。如果没有可检测的活性，伪DUBs最容易通过与有催化能力的同源物的序列和结构相似性来识别。

DUBs可以辨别连接类型、链长、修饰剂（Ub或Ubl）和/或Ub所连接的底物。USP家族的成员通常是无连接特异性的，通常被称为杂交；然而研究人员已经发现USP9X和USP7令人惊讶的连接依赖性处理活动，这两个USP以前被认为是无特异性的。USP家族的其他成员是否具有类似的特异性还有待探讨。相反，OTU、MINDY、ZUFSP和JAMM家族的成员往往具有连锁特异性。

由于泛素化参与了几乎所有的生物过程，包括蛋白质稳态、转录调控、DNA修复、内吞和内溶酶体分拣、自噬、免疫反应和干细胞更新，毫不奇怪，DUBs也是这些不同细胞功能的主要参与者。因此，它们的失调与许多疾病有关。如神经元、心血管、发育、自身免疫疾病和癌症等。

2.生物素变体：选择性DUB靶向的组合方法

开发具有化学探针质量的小分子DUB结合剂是一个重大的障碍。USP7抑制剂就是一个很好的证明；因此，大多数DUBs还没有被成功锁定。某些特征证明了它们的可操作性差：(1)大而浅的相互作用界面；(2)催化区要么定义不清，要么难以区分同源物；(3)高度可塑性和隐秘的结构，受广泛的异生机制支配，对各种刺激作出反应。幸运的是，支撑一个特定DUB活性的分子细节可以是独特的，因此可以被选择性的调节剂所利用。

由于缺乏可靠的DUBs小分子调节剂，Sidhu小组开发了一个蛋白质工程和噬菌体展示平台，以产生UbVs，能够审视Ub蛋白酶体系统（UPS）的情况。以Ub为支架，针对一组DUB靶点筛选了大规模随机化的UbVs库，以增强亲和力和选择性。以Phe-4、Ile-36和Ile-44斑块为中心的Ub表面是一个保守的核心功能表位，对分子识别很重要。因此，UbVs可以同时获得亲和力和选择性。

类似于化学探针的方式对待UbVs。在可能的情况下，应提供对其效力、选择性和作用机制（MoA）的整体验证。研究人员建议社会各界利用体外和体内方法为新开发的UbVs的验证设定标准。最好用正交的生物物理方法对效力进行量化，并辅以生物化学证据（如酶活性测定）。目标的选择性至少应针对密切相关的结构同源物或通过分析更大的潜在交叉反应目标子集来确定。UbV在细胞中的表达可以通过监测共定位和特定途径的表型变化提供目标选择性的证据。亲和纯化加上质谱分析（AP-MS）可用于确认UbV和目标的紧密结合。最后，应尝试确定MoA的特征。这可以通过生化方法建立，如诱变和活性测定。理想情况下，这些数据将得到高分辨率的晶体结构等结构信息的支持。

如上所述，活体细胞或细胞裂解液中的UbVs的靶标验证相对简单明了。细胞传递通常是通过编码感兴趣的UbV的质粒的瞬时转染或通过产生可诱导的稳定系（如病毒转导）来进行的。另外，纯化的UbVs与活性基团结合后可以加入到细胞裂解液中，以促进基于活性的蛋白质分析（ABPP，下文讨论）。然而，这些方法不允许以类似药物的方式进行体内输送。由于UbVs是细胞不可渗透的，因此需要有递送方法来获得其细胞内的目标，并评估其在活细胞中的治疗潜力。

以前曾对生物制药的递送方法进行过审查。相对于病毒介导的转导，传递纯化的蛋白质，如UbVs，可以更好地控制剂量和药代动力学。细胞穿透肽（CPP）和成孔毒素已被用来在细胞内传递基于Ub的探针，前者更适合于体内应用。类病毒颗粒（VLPs）也是一种蛋白质递送的手段，并且可以被设计成具有不同的细胞倾向性。纯化的UbVs在细胞内递送的另一个机会是通过用寡核苷酸进行修饰，生成可有效内吞的蛋白核心球形核酸（proSNAs）。

3.基于活动的探针：捕捉行动中的DUBs

基于活性的探针（ABPs）长期以来被用作研究代谢和信号酶机制的工具，包括DUBs。当应用于整个蛋白质组时，ABPs可以解决独立于表达水平的酶活性变化。它们被用来发现新的DUBs，并确定Ub结合的DUBs的结构，用于化合物/抑制剂的筛选和Ub底物的分析。

这些适应性强的分子包含三个功能元素：(1)赋予目标特异性的识别元素，(2)与目标催化残基共价反应的反应性分子（或弹头），(3)促进检测和/或富集ABP标记的目标酶的报告标签（或手柄）。DUB蛋白酶最常用的识别元素是Ub。与S1位点结合的单UbC端亲电体是最简单的DUBABP。为了研究连接特异性，已经开发了占据多个Ub结合位点的多UbABPs。这种探针的设计需要仔细考虑Ub连接类型、Ub分子之间的连接体和反应性基团的位置。研究人员最近合成了二Ub和三Ub混合ABPs，以确定USP9X的机制。研究人员发现，内切是K11和K63的首选，但不是K48连接的三UbABP，这些ABP包含一个不可裂解的远端连接和一个本地的、可裂解的近端异肽连接。有趣的是，K48连接的tri-Ub完全由外裂解模式处理。解决这一问题的ABP是一个含有远端迈克尔受体弹头和本地可裂解的近端异肽键的三聚体。

DUB相互作用者可分为三类。(1)构成性结合伙伴，通常是较大的大分子复合物的一部分，如USP22/SAGA-DUBm和CSN5/COP9信号体；(2)低亲和力、短暂的结合伙伴，如USP19/SIAH复合体和USP8/NRDP1；(3)凭借Ub修饰而结合DUB的泛素化底物。使用CRISPR编辑技术在DUBs中引入失活突变的例子仍然非常有限。谨慎的做法是，将遗传干扰的结果与药物干扰的结果进行比较，后者专门针对DUBs的酶活性。这些工作同时进行，将验证所研究的DUBs的功能作用。在最近的一个例子中，Dirks和Angers小组使用全基因组CRISPR筛选，从患者衍生的胶质母细胞瘤干细胞中发现USP8是脆弱基因之一，然后使用慢病毒传递UbV抑制剂验证USP8是一个可操作的治疗目标。

结论与讨论

DUB研究仍然是一个充满机会的领域。小分子抑制剂和生物探针，如ABPs和UbVs，都被证明是研究DUB酶家族生物学的有力工具。虽然小分子是黄金标准的治疗支架，但UbVs对于扩大现有的DUB调节剂至关重要。DUBs的可药性，特别是USP7的可药性，它具有典型的USP折叠，缺乏许多USP家族成员中常见的插入物，以及最近发表的几种高质量的其他USPs抑制剂，将吸引人们对这个具有挑战性但重要的蛋白质家族的药物发现产生新的兴趣。到目前为止，化学探针质量的抑制剂非常少。研究人员观察到大约15种，在超过100个DUB目标中仅有6种被击中。这只构成了七个家族中的三个。近年来，许多新的DUBs结构被报道，人工智能驱动的、结构引导的小分子药物发现将是一个特别有趣的应用。

鉴于DUBs的天然大Ub结合口袋，UbV技术特别适合于寻找有效的DUB抑制剂。这种技术适合于快速和低成本地产生抑制剂。这些DNA编码的抑制剂可以用慢病毒系统或质粒介导的转染来传递，以研究同源DUBs的细胞功能。然而，直接递送细胞不可渗透的纯化的UbVs需要进一步解决。最近成功的COVID-19的纳米颗粒包裹的mRNA疫苗是另一种尚未尝试的潜在UbV递送技术，值得探索。

与磷酸化、甲基化和乙酰化等其他PTM相比，泛素化是一种极其复杂的PTM。一套近乎完整的针对每个DUB的高质量工具试剂，结合遗传干预和蛋白质组学，将成为在细胞水平上研究DUB的理想选择。

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全文链接：https://www.mdpi.com/2218-273X/12/5/703

来源：小齐的科学讲堂