摘要：在生物结构成像领域，纳米级分辨率的光学显微镜因其物镜工作距离短，难以对大型样本（如完整哺乳动物脑）进行深层成像。尽管基于水凝胶的透明化与膨胀技术提升了光学透明度与有效分辨率，却也进一步增大了样本与物镜之间的距离。机械切片虽可突破工作距离限制，但常导致样本变形、
在生物结构成像领域，纳米级分辨率的光学显微镜因其物镜工作距离短，难以对大型样本（如完整哺乳动物脑）进行深层成像。尽管基于水凝胶的透明化与膨胀技术提升了光学透明度与有效分辨率，却也进一步增大了样本与物镜之间的距离。机械切片虽可突破工作距离限制，但常导致样本变形、撕裂与信息丢失，尤其在处理水凝胶包埋的膨胀样本时，这些问题更为突出，阻碍了对完整样本进行连续、高保真的纳米级三维重建。
鉴于此，伊利诺伊大学芝加哥分校Ruixuan Gao助理教授提出了一种名为VIPS（volumetric imaging via photochemical sectioning）的新型成像策略，通过光化学切片替代机械切片，实现对超出显微镜工作距离的完整样本进行纳米级成像。该方法利用含有光可裂解交联剂的高吸水性水凝胶，在紫外或多光子激发下快速降解，结合晶格光片显微镜进行连续“在块”成像，最终通过高性能计算流程完成体积数据的拼接与分析。研究团队成功对两只完整小鼠嗅球进行了成像，并在神经退行性病变样本中发现了轴突的离心性退化模式，展示了VIPS在超大体积样本纳米级成像中的潜力。相关研究成果以题为“Mesoscale volumetric fluorescence imaging at nanoscale resolution by photochemical sectioning”发表在《science》期刊，并选为封面！
【光降解性超吸水水凝胶的设计与合成】
为实现光化学切片，研究团队设计并合成了一种光可裂解交联剂，并将其引入常用的聚丙烯酰胺-聚丙烯酸钠水凝胶中，形成“PC-gel”。该水凝胶在光学透明性、机械弹性及膨胀行为方面与传统的“Bis-gel”相当，膨胀误差控制在~0.3至1.3%之间。实验显示，PC-gel在405 nm激光照射下可在约80分钟内完全降解（图1D），且降解时间随交联剂浓度增加而延长（图1G）。在细胞样本中，PC-gel包埋的样本在光照后目标区域被精确去除，而对照组Bis-gel则无此现象（图1E, 1F）。
图 1. VIPS
【空间精确的光降解实现】
为避免非目标区域的光降解，研究采用双光子激发进行光切片。实验表明，双光子VIPS可在鼠标脑组织中精确降解目标区域，边界清晰（图2B–2D），并成功实现了对~3.8 mm厚脑组织条带的连续成像，远超物镜的~2.6 mm工作距离（图2F, 2G）。为进一步提升成像速度并降低光漂白，研究团队将VIPS与晶格光片显微镜结合。通过引入第三物镜进行高斯光片照明，实现了对样本表面的平行光切片。在~4.4倍膨胀的人海马样本中，VIPS成功将成像深度提升至原来的五倍，并保持了纳米级分辨率（有效体素尺寸为22 × 22 × 59 nm），使得直径小至~150 nm的轴突也能被追踪与重建。
图 2. 使用 2P VIPS 以纳米级分辨率对小鼠脑组织进行体积荧光成像
【全小鼠嗅球的轴突与髓鞘成像】
为验证VIPS的可扩展性，研究团队对7周龄野生型（WT）小鼠嗅球进行了双色成像。样本经~2倍膨胀后，体积达~6.4 × 9.4 × 4.3 mm，通过9轮交替成像与光切片，共获取17,280个体积图块，原始数据量达~0.5 PB（图3B）。经PetaKit5D与PetaVIPS处理后，重建出整个嗅球的三维结构（图3C），并清晰展示了各解剖层中轴突与髓鞘的分布特征（图3D–3I）。
图 3. 使用 LLSM VIPS 对小鼠 OB 进行纳米级分辨率的体积荧光成像
【神经退行性嗅球中的轴突退化与髓鞘异常】
为进一步探究神经退行性病变，研究团队对7周龄NPC1突变小鼠嗅球进行了成像。与WT相比，NPC1嗅球中轴突与髓鞘密度在GL、EPL/MCL和IPL层显著下降（图4C），轴突体积密度整体降低，尤其在EPL/MCL层下降达~56.6%（图4D）。髓鞘化轴突的比例在IPL和GCL层分别下降36.2%和46.9%（图4F），表明这些层中髓鞘化轴突更易受损。此外，髓鞘化特征在不同区域之间存在显著异质性（图4G）。
图 4. 在单轴突分辨率下对轴突和髓鞘进行全轴分析
【全嗅球范围的拓扑与追踪分析】
通过单轴突追踪与方向分析，研究发现WT嗅球中轴突数量在各层间保持稳定，而NPC1嗅球中从深层至外层轴突数量逐层减少，提示退化由外向内发展（图5A）。轴突方向从GL层的腹背轴向GCL层的前后轴转变（图5F–5I），而在NPC1的IPL层中，沿腹背轴投射的轴突减少最为显著（图5G）。此外，NPC1的IPL和GCL层中剩余轴突主要沿前后轴分布，提示其可能通过LOT投射至嗅皮层（图5F, 5G）。
图 5. 单轴突分辨率的 OB 范围地形图和纤维束造影
【总结与展望】
VIPS通过光化学切片与高分辨率成像的迭代结合，成功突破了物镜工作距离的限制，实现了对厘米级甚至更大体积样本的纳米级连续成像。该技术无需机械接触，避免了样本变形与信息丢失，兼容多种水凝胶透明化与膨胀方法，并可集成于现有显微镜系统实现自动化采集。结合晶格光片成像与高性能计算，VIPS为全脑连接组、细胞与亚细胞水平的研究提供了可行路径。未来，随着标记技术、非刚性配准算法、AI辅助分析与数据存储能力的进一步发展，VIPS有望推动生物样本从稀疏采样走向全样本定量化研究的新阶段。
来源：鱼鱼时尚