Nat Commun丨何川团队CRACI技术绘制 RNA 二氢尿嘧啶修饰全景图

摘要：RNA 分子上的化学修饰是生命系统中一个重要的调控层。它们调节转录产物的稳定性、折叠和翻译效率，对细胞状态与疾病发生具有深远影响。在已知的一百五十余种 RNA 修饰中，二氢尿嘧啶（dihydrouridine，简称D）是一种古老且普遍的修饰形式，主要分布在

RNA 分子上的化学修饰是生命系统中一个重要的调控层。它们调节转录产物的稳定性、折叠和翻译效率，对细胞状态与疾病发生具有深远影响。在已知的一百五十余种 RNA 修饰中，二氢尿嘧啶（dihydrouridine，简称D）是一种古老且普遍的修饰形式，主要分布在 tRNA 的 D-loop 区域。D 是 tRNA 中丰度最高的修饰之一，在小 RNA 群体中，D/U 的比例甚至可达 5–10%。这种修饰被认为能够增加 RNA 骨架的柔性，使 tRNA 在翻译过程中更具结构可塑性。然而，长期以来受限于检测技术的灵敏度，我们对于哺乳动物中 D 修饰的精确分布、修饰比例及其生物学功能仍知之甚少。

近期，芝加哥大学何川教授团队与香港科技大学张理升教授团队在 Nature Communications 发表论文，

Quantitative CRACI reveals transcriptome-wide distribution of RNA dihydrouridine at base resolution报道了一种新型RNA修饰测序技术——CRACI（ Chemical Reduction Assisted Cytosine Incorporation sequencing ）。这项技术首次实现了对D修饰的单碱基、定量化测序，并绘制出人类、鼠类及植物tRNAD修饰全景图，明确DUS2L是人类线粒体tRNAwriter，还揭示了相邻D位点间的顺式调控关系。

图1 CRACI 的化学原理。还原 D 后产生 T→C错配信号，用于定量检测。

传统 D 检测方法依赖逆转录酶在修饰位点的“停顿”信号，常因背景噪音高、读通率低而难以区分真正的修饰。CRACI 则采用化学还原 + 错配检测策略：利用硼氢化钾（KBH₄）还原 D 的双键结构，使逆转录过程中 D 位点更易发生 T→C 错配。研究团队通过优化反应体系（尤其是 dGTP/dNTP 比例与 HIV RT 的使用），将修饰信号转化为可量化的错配率，并针对 256 种序列环境建立了标准曲线，从而首次实现了不同位点 D 修饰比例的定量测量。这种设计让研究者得以像测量甲基化水平一样，精确“量出”每个 tRNA 上 D 的占比，为研究修饰动态变化奠定了基础。

从细胞质到线粒体：完整的 tRNA D 修饰图谱

利用 CRACI，研究团队系统地描绘了人类肝细胞（HepG2），小鼠胚胎干细胞，与拟南芥中的D 修饰分布。结果显示，D 主要集中在 tRNA 的 16、17、20、20a、47 位点，并且绝大多数位点接近100%修饰。通过依次敲低四个哺乳动物 DUS 同源酶（DUS1L、DUS2L、DUS3L、DUS4L），研究进一步assign了各自的底物特异性：DUS1L 负责 D16/D17， DUS2L 负责 D20， DUS3L 负责 D47， DUS4L 负责 D20a。

更令人瞩目的是，研究团队在人类线粒体 tRNA中首次清晰地检测到 D16、D17 和 D20 三个位点的修饰信号。其中，D16 与 D17 位点的存在是首次被报道，打破了以往对 DUS2L 仅催化 D20 位点的传统认知。研究结果明确指出，DUS2L 是线粒体内唯一负责 D 修饰的“writer”酶，其作用范围比此前认为的更广。这一发现不仅扩展了我们对 DUS2L 功能的理解，也为线粒体 tRNA 的修饰调控、蛋白合成以及能量代谢调节提供了新的分子线索。

研究还将 CRACI 应用于拟南芥样品，发现植物中 tRNA 的 D 分布模式与哺乳动物类似，但更为多样，且在叶绿体 23S rRNA 上检测到与细菌相同位置的 D 位点。这一发现暗示了 D 修饰在从细菌到真核细胞器之间的进化保守性。

相邻修饰之间的“微妙博弈”

除了定位“谁来写”，CRACI 还揭示了修饰间的相互作用：在 tRNA D-loop 内，位于相邻位置的 D20a 会抑制 D20 的形成。当研究者敲低 DUS4L 使 D20a 减少时，D20 修饰比例显著上升，但反向并不成立。进一步结合单个 tRNA 分子的修饰状态与 pre-tRNA 的修饰特征分析，研究团队验证了这一单向调控关系。这说明 D 修饰的安装可能具有严格的顺序性与层级性，局部结构变化或许是“writer”选择底物的重要决定因素。

mRNA 上的 D：存在，但极其稀有

关于 mRNA 是否含有 D，一直存在争议。团队采用体外转录的无修饰 RNA 作为对照，严控背景噪音后发现：在细胞 mRNA 中确实存在少量 D 位点，但修饰比例低（约 10–40%），数量极为有限。这表明 D 在 mRNA 中的出现并非普遍事件，更可能与局部结构或核苷代谢有关。

研究意义与展望

该工作为RNA修饰研究提供了一个重要的技术突破。CRACI 不仅在方法上实现了高灵敏、可定量、跨物种的 D 测序，也在生物学上带来了三方面新认识：（1）明确了人类线粒体D修饰的酶学来源（DUS2L）。（2）揭示了tRNA上修饰之间的顺序与互作。（3）澄清了mRNA中D修饰的稀有性与低丰度。

随着该方法的普及，研究者将能够追踪不同细胞类型、发育阶段、应激条件下 D 修饰的动态变化，进一步理解这一“柔性修饰”在调控 RNA 结构与功能中的角色。 CRACI 也为探索 RNA 修饰在代谢重编程、线粒体疾病、乃至癌症发生中的作用打开了新窗口。

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