摘要：超分辨率显微技术通过突破光学衍射极限彻底革新了生物成像领域，但现有方法大多依赖荧光标记，其提供的化学信息有限。虽然基于拉曼和红外光谱的振动成像技术具有天然分子对比度优势，但由于信号强度较弱，要同时实现高空间分辨率与高化学特异性仍面临挑战。Fu等人开发的结构化照
超分辨率显微技术通过突破光学衍射极限彻底革新了生物成像领域，但现有方法大多依赖荧光标记，其提供的化学信息有限。虽然基于拉曼和红外光谱的振动成像技术具有天然分子对比度优势，但由于信号强度较弱，要同时实现高空间分辨率与高化学特异性仍面临挑战。Fu等人开发的结构化照明显微中红外光热显微镜(SIMIP)作为新兴成像平台，实现了超越衍射极限的化学键选择性与高速宽场检测能力。通过调控振动红外吸收引发的荧光量子产率，SIMIP可同时实现纳米级空间分辨率与高保真红外光谱采集。这种增强分辨率与化学特异性的协同效应，使SIMIP成为研究复杂生物系统和先进材料的多功能工具，在生物医学和材料科学领域开辟了全新应用前景。该工作以Breaking the diffraction limit in molecular imaging by structured illumination mid-infrared photothermal microscopy为题发表在了Advanced Photonics上。
光学成像技术通过揭示自然界的运作机制，为众多科学领域带来了革命性突破。随着分辨率的不断提升，单分子荧光技术已成为研究亚十纳米尺度结构的主流手段。尽管超分辨率技术已取得诸多成果，但其应用范围仍局限于特定蛋白质荧光标记物，导致小分子靶向检测面临挑战。为直接获取超越荧光标记的分子信息，振动光谱与成像技术应运而生。值得注意的是，由于这些技术能与分子键的固有振动产生相互作用，振动光谱与显微成像凭借独特优势日益受到青睐——无需复杂的样本处理或标记步骤，即可提取化学信息。
近几十年来，振动光热成像技术取得了快速进展，这类技术通过检测由振动红外(IR)吸收引发的物理变化实现成像。这些技术包括光热透镜技术，用于探测局部折射率的变化；光声成像技术，用于测量声信号随温度变化的差异；定量相位成像技术，用于捕捉光路长度的变化；以及光学相干断层扫描技术，用于检测干涉变化。通过利用可见光检测，这些方法在保持其化学特异性的同时，通过振动吸收实现了远超传统红外成像的衍射极限的空间分辨率。值得注意的是，突破衍射极限对振动光谱技术而言始终是个难题。这类技术与典型拉曼散射截面(10-30 cm²)和红外吸收截面(10-21 cm²)相比，其信号强度较弱得多——而荧光截面则高达10-16 cm²。尽管已取得合成孔径技术、高阶谐波锁相检测、饱和效应及光开关拉曼探针等突破性进展，但固有的信号强度不足仍制约着先进单分子荧光超分辨率技术的直接应用。为攻克这一难题，学界重点研发了结合振动光谱技术的高灵敏度荧光方法，特别是荧光增强中红外光热显微镜(F-MIP)。与传统MIP中的温度调制折射率变化相比，荧光发射效率对温度调制的响应性显著更高，这为高灵敏度化学成像作为读出方法提供了多种可能性。
然而，并非所有基于荧光的超分辨率技术都能直接应用于振动光热法以突破衍射极限。例如，单分子定位技术（如光激活荧光显微镜PALM）或STORM（受激旋转光学显微镜）在检测单分子荧光量子产率因局部加热而产生的变化时存在困难。与此同时，STED型检测技术采用的淬灭环形光束会因荧光淬灭不可避免地引发局部加热，从而掩盖红外脉冲引发的细微加热效应。
结构化照明中红外光热显微技术(SIMIP)展现出作为高效灵敏读出方法的巨大潜力。该技术通过莫尔效应，将原本无法获取的高频空间信息转化为可检测的低频范围——其原理是利用相干光束受控干涉产生的精细图案进行叠加。当前SIM技术已实现数百帧的高速读取，并具备高通量宽场成像能力，这使其成为突破衍射极限、实现高速振动成像的潜力候选技术。
本文介绍了一种新型高速振动成像技术——结构化照明中红外光热显微镜(SIMIP)，该技术突破了衍射极限。SIMIP通过结构化照明技术将高频空间信息编码为可检测的低频模式，成功解决了传统振动成像技术因速度与分辨率权衡而受限的问题。其同步宽场检测技术不仅能捕捉低于衍射极限的空间特征，还能呈现特定化学键的对比度差异，从而在全视场范围内提取丰富的分子信息。SIMIP技术的创新之处在于其独特结合了不同物理过程与图像重建能力：(1)利用荧光检测对振动特征的敏感性；(2)通过宽场结构化照明突破衍射极限；(3)运用精密的重建算法将空间分辨率提升至衍射极限之外。这些能力的协同作用使SIMIP成为生物医学与材料科学领域多种应用的强大工具。
SIM技术通过利用SIM框架内的莫尔效应突破衍射极限（图1）。简而言之，其物理原理可通过倒易空间分析来理解：传统光学传递函数(OTF)为可检测的空间频率设定了硬性边界。当采用具有相位变化的结构化照明模式时（图1a,b），高频信息会被下移至与照明模式垂直轴方向的可检测低频范围。通过有规律地改变这些条纹图案的方向，通过频率空间的扩展实现了更高的各向同性分辨率（图1c）。因此，使用结构照明技术能够缩小系统的点扩散函数(PSF)，从而突破衍射极限两倍之多（图1d）。
SIMIP技术通过利用MIP效应获取分子特异性信息。该方法采用脉冲红外泵浦光束，选择性激发特定分子键的振动吸收，随后通过非辐射弛豫从激发态分子中释放(图1e)，从而产生局部加热（提高温度T）并降低邻近荧光团的量子产率（降低Φ值）。通过对不同红外波长下结合键选择性加热与未加热条件下的SIM图像进行对比分析，可获取每个像素点的红外光谱响应(图1f)。值得注意的是，由于SIMIP信号源自配对的SIM图像，其空间分辨率与传统SIM成像技术相当。
SIMIP的实现过程异常简单，只需在现有商用SIM系统中引入反向传播配置的中红外激光束即可完成最小化改造(图2a)。采用500千赫兹、300纳秒脉冲的量子级联激光器(QCL，型号MIRcat，由Daylight Solutions公司生产）进行中红外激发，可引发荧光团量子产率的瞬态热调制。理想情况下，需将红外脉冲与探测脉冲的持续时间精确同步，以确保荧光读取时获得最大温度调制效果，同时避免因大量热耗散而影响最佳分辨率。QCL光束在样品平面处进行弱聚焦处理，以匹配大视场范围。光学系统由488纳米连续波激光器构成，该激光器通过单模光纤传输至自由空间。激光经偏振分束器进入空间光调制器(SLM)，通过衍射入射光束形成±1 st级次结构化照明图案，同时用掩模阻挡零级光束。空间光调制器以千赫兹频率对这些图案进行相位和方向的调制。在光路中加入一个多波段二向色镜，以引导激发光束，并有效地将发射的荧光与激发光束分离。
荧光信号通过物镜收集并由sCMOS相机捕获，实时显示与控制则依托ZYNQ嵌入式系统平台实现——该平台集成了ARM处理器和基于FPGA的可编程逻辑。本研究采用的HIS-SIM系统融合了先进的数据处理算法，包括Hessian SIM和稀疏反卷积技术。Hessian SIM利用Hessian矩阵和生物结构在多维空间连续性的先验知识，重建SIM图像所需的光子剂量不到传统SIM技术的10%。稀疏反卷积技术通过利用生物结构的稀疏性和连续性，使HIS-SIM在支持超过24 Hz的实时超分辨率成像的同时，实现了~60纳米的最大空间分辨率。SIM技术的有效性不仅依赖光学设备，更需要用于数据后处理的先进算法来提升空间分辨率，从而实现计算超分辨率。目前已有多种算法经过优化，可显著提高数据处理速度与成像分辨率。
该系统通过将红外泵浦脉冲与SIM采集同步进行（图2b,c），获取配对的“热态”（红外开启）和“冷态”（红外关闭）图像。每种状态都需要在不同结构化照明配置下采集九组原始图像对才能完成重建。原始图像采集的sCMOS曝光时间为每张重建SIM图像30毫秒，而红外脉冲持续时间则为80毫秒以确保热态图像采集期间的连续照射。由于荧光发射效率受温度影响，当发生振动吸收时，热态图像的荧光强度会弱于冷态图像。通过从冷态图像中减去热态图像，即可获得SIMIP图像。
为了测试SIMIP的光谱保真度，本文使用了由热敏荧光染料（基于硝基苯并恶唑的荧光染料）均匀掺入的200纳米聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠子（UFPA0102G，无锡瑞格科技）作为模型系统。SIMIP光谱的采集方法是通过将量子级联激光器(QCL)以1 cm-1的间隔扫描1420-1778 cm-1的波长范围，并在每个波长处收集SIMIP图像(图3a-3d)。SIMIP光谱经过6次平均处理，并通过测量QCL的功率谱进行归一化处理，随后与传统傅里叶变换红外光谱(iS50R型，NICOLET公司，光谱分辨率为4 cm-1）获得的参考光谱进行对比(图3b)。观测到的光谱在指纹区域的峰位和相对强度均表现出良好的一致性，证明SIMIP能够像传统光谱技术一样准确还原化学键信息。SIMIP图像在不同波数下呈现差异化的响应特性，彰显了其光谱选择性(图3c,d)。经过基线校正后的原始荧光信号轨迹显示，信号波动幅度最高达26%，显示出显著的光热调制深度。不过这种效应主要源于较大尺寸微珠中的热量积聚，这是由于时间同步性未达到最佳状态所致。未来可通过增强电子控制系统有效解决这一局限性。根据这些测量结果以及常见荧光团每开尔文温度变化幅度通常为~1%的典型数据，本文估算出空气中这2-μm聚合物微珠的温度升高幅度为~20K。
为定量评估SIMIP的分辨率提升效果，本文采用均匀标记荧光分子的200纳米PMMA微珠开展对比成像研究。在羧基C=O吸收带(1730 cm-1）处进行的初始SIMIP成像显示，其化学成像成功突破了衍射极限(图3e)。本文在相同视场条件下对SIMIP与传统F-MIP/F-PTIR进行了直接对比(图3e,f)，通过单个微珠的强度分布分析量化分辨率(图3g)。F-MIP/F-PTIR图像源自同一显微镜未经处理的原始数据，未使用结构化照明和图像处理技术。测得SIMIP的半高全宽(FWHM)值为335纳米，F-MIP/F-PTIR则为444纳米。经已知微珠直径(200 nm)的去卷积处理后，本文分别确定SIMIP和F-MIP/F-PTIR的真实空间分辨率为269纳米和397纳米。这种~1.5倍分辨率的提升在分析紧密排列的微珠时尤为明显(图3h)，SIMIP技术能清晰分辨出相邻结构——这些结构在F-MIP/F-PTIR技术下仍存在模糊性。尽管F-MIP/F-PTIR方法已接近其理论极限，但SIMIP通过结构化照明成功突破了这一障碍。然而，目前的SIMIP仍有改进的空间，因为理论上SIM的分辨率提升是两倍的。这是由于当前系统中采用长工作距离物镜进行原型制作时存在放大倍率不匹配的问题。荧光团在微球中的均匀分布确保了化学信息与空间信息的精准共定位，从而验证了本文分辨率测量结果的可靠性。
为定量评估OTF扩展能力，本文选取了SIMIP和F-MIP/F-PTIR的完整图像进行FFT分析(图3i,j)。与F-MIP/F-PTIR图像相比，SIMIP的FFT分布图在参考边界（黄色圆圈）之外展现出更显著的扩展范围，这表明SIMIP在捕捉高频空间信息方面具有更强的能力。为验证SIMIP技术在实现亚衍射极限成像与化学对比度同步获取方面的能力，本文对200纳米荧光聚苯乙烯(PS)微珠（UFPS0102G，无锡锐格科技）与PMMA微珠（UFPA0102G，无锡锐格科技）的混合样本进行了分析。尽管这两种材料使用相同的荧光染料标记，但它们在特征区域展现出截然不同的振动特征，这使其成为测试SIMIP化学分辨能力的理想候选对象。传统荧光显微镜(图4a)无法区分PS和PMMA微珠，通常呈现为未解析的聚集体，看似单一的微珠实则由多个颗粒组成。
相比之下，SIMIP成像技术(图4b)不仅能解析这些聚集体中的单个微珠，还能通过多波长振动成像技术(图4c-f)区分其化学成分。这种空间分辨率与化学选择性的双重提升，彰显了SIMIP在亚衍射尺度下揭示分子异质性的独特优势——这正是传统荧光显微技术难以企及的突破。
SIMIP将传统SIM已有的功能拓展到了化学成像的新领域。尽管SIM在阐明复杂的细胞结构（包括细胞外囊泡(EVs)、血小板超微结构、细胞骨架组织、神经元的突触和树突形态、以及细菌动态等）方面已展现出极大的价值，但SIMIP引入了化学特异性的另一维度。这种整合技术有望以前所未有的分辨率检测小分子代谢物及其与生物结构的相互作用。尽管活体系统中的水环境通过更高的热容和导热性降低了温度升高并加速冷却，但通过适当缩短泵浦脉冲持续时间并采用脉冲探针，SIMIP信号仍可得到补偿。不过，相较于传统光热方法，荧光检测技术仍保持更高的灵敏度。这一突破可能揭示代谢物分布及其与细胞结构功能关系的新见解，有望彻底改变本文对纳米尺度细胞生物化学的理解。
需要指出的是，SIM技术通常默认被归类为荧光显微镜的一个分支，尽管结构化照明策略在荧光领域之外的成像和传感应用中也得到应用。正如前人文献所述，用于相干检测成像的结构化照明通常不被视为突破衍射极限。然而在荧光显微镜中，SIM技术作为激发源可增强特定波长下的荧光发射，当配合适当算法时，其横向分辨率可达60纳米并实现2×倍率提升，这已超越传统荧光成像的常规衍射极限。
尽管荧光成像通常被视为一种标记技术，但基于自发荧光的无标记检测技术近年来发展迅速，展现出减少干扰、实现非侵入式检测的潜力。SIMIP系统的设计本身就兼容自发荧光检测，只需对光学系统进行简单改造——将宽场SIM转换为点扫描SIM，即可实现自发荧光的结构化激发。例如，通过自发荧光检测的光热红外光谱技术已被证实无需外源荧光标记物即可表征温度变化，其中红外诱导的温度变化会调控双光子激发的自发荧光。此外，还提出了一种利用自发荧光的宽场光热检测方法，该方法采用波长更短的探针光束，并具备良好的仪器兼容性。
尽管荧光检测的振动成像技术已崭露头角，例如键选择性荧光检测红外激发(BonFIRE)显微镜和受激拉曼激发荧光(SREF)技术，但SIMIP代表了一种根本不同的方法。虽然这些方法都采用红外泵浦和荧光读取方案，但SREF/BonFIRE依赖外源荧光团，仅能检测荧光分子自身的固有振动特征。相比之下，SIMIP的信号源自邻近分子红外吸收引发的荧光强度调制，这为靶分子选择提供了更大的灵活性。这一关键区别使SIMIP能够探测更广泛的分子种类，而不受荧光团光谱特性的限制。
尽管如此，当前的SIMIP系统在提升成像速度方面仍具有巨大潜力。现有技术的主要瓶颈在于商用SIM系统的封闭架构，导致QCL脉冲序列的调制速度较慢。未来优化方向将聚焦于主时钟的全面整合，通过实现相机曝光窗口与脉冲泵浦、脉冲探测器的精准同步，使千赫兹频率下的热帧与冷帧交替采集成为可能。实施这种高速同步策略可使成像速率大幅提升，实现视频级帧率捕捉甚至每秒数百帧的突破。
综上所述，本文开发了SIMIP这一突破衍射极限的化学成像平台，通过结合振动光热光谱技术的高灵敏度与分辨率优势。SIMIP利用温度依赖性荧光调制技术，有效克服了传统振动成像中信号微弱的难题。本文已验证SIMIP在光谱保真度和空间分辨率方面的双重提升，成功实现纳米级化学物质的精准区分。未来SIMIP技术的发展将受益于SIM重建算法的持续优化以及更高温度敏感性荧光团的应用。
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来源：凯视迈精密测量
