大肠杆菌的“基因装修队”——CRISPR-Cas9

摘要：大肠杆菌基因编辑的核心原理是精准识别并修饰特定DNA序列，通过人工设计的工具（如酶、向导RNA等）打破细菌自身的DNA修复平衡，实现目标基因的敲除、插入或替换，本质是对细菌基因组进行“定向改造”。主要涉及以下技术，CRISPR-Cas9系统（高效精准）和同源重

大肠杆菌基因编辑的核心原理是精准识别并修饰特定DNA序列，通过人工设计的工具（如酶、向导RNA等）打破细菌自身的DNA修复平衡，实现目标基因的敲除、插入或替换，本质是对细菌基因组进行“定向改造”。主要涉及以下技术，CRISPR-Cas9系统（高效精准）和同源重组技术（依赖宿主修复），下面由小源主要向大家介绍 CRISPR-Cas9 系统：

一、技术原理

CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）是细菌基因组中一段特殊的DNA序列，当噬菌体首次入侵时，细菌会捕获其部分DNA片段（称为“间隔序列”），插入自身CRISPR区域形成“记忆”；当同种噬菌体再次入侵时，细菌会通过CRISPR序列转录出向导RNA（gRNA），引导Cas9蛋白精准切割噬菌体DNA，将其摧毁。

人工改造后，CRISPR-Cas9系统保留了核心功能：通过人工设计的gRNA定位目标基因，Cas9蛋白切割DNA双链，最终利用生物自身的DNA修复机制实现基因的定向编辑。

图：CRISPR-Cas9原理

二、实验步骤

1、设计向导RNA，选择出综合评分较高的sgRNA（注：输入序列为目标基因的CDS序列）。

a. 常见sgRNA设计工具：

Zhangfenglab、CHOPCHOP、Benchling、CRISPick、CRISPRDesign Tool(http://crisper.mit.edu/)。

b.筛选gRNA需满足：

靶点位于基因开放阅读框（ORF）内；脱靶评分低（

c.合成gRNA序列并克隆至pTarget质粒（含Cas9表达元件）。

2、模块构建

a.同源臂设计：扩增目标基因上下游各500bp同源臂（引物设计包含与pTarget质粒同源的酶切位点）。

b.重叠PCR：连接上下游同源臂并插入至载体中，构建敲除供体质粒（含筛选标记，如卡那霉素抗性基因）。

3、载体构建与质粒提取

a.将gRNA序列克隆至pTarget质粒（限制性内切酶如XbaI/BamHI）。

b.连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板。

c.挑取单菌落，摇菌后提取质粒，通过测序验证gRNA序列正确性。

4、化学转化与电转化

a.化学转化（供体质粒）：将敲除供体质粒转化至DH5α感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB平板。

b.电转化（CRISPR系统）：将pTarget质粒（含gRNA和Cas9）与敲除供体质粒共转化至菌株，电击感受态细胞。复苏后涂布含双抗（氨苄青霉素+卡那霉素）的LB平板。

5、PCR鉴定

a.挑取转化后的单菌落，煮沸法提取基因DNA。

b.使用引物对（同源臂外侧）进行PCR扩增，预期产物为敲除后的缩短片段。C.电泳检测，与野生型菌株对比。

6、测序鉴定

PCR产物纯化后送测序，可使用SnapGene软件或者测序比对网站去比对目标区域序列，确认基因是否敲除成功。

7、阳性克隆扩增与保存

将敲除成功的单克隆菌株进行扩大培养，经检测合格后冻存。

8、结果分析

a.转化效率分析

图：PCR鉴定结果

图：敲除测序验证（测序结果显示目标区域被精确删除，上下游同源臂正确连接）

c.表型筛选

图：表型筛选（敲除菌株在含卡那霉素的LB平板上正常生长，而野生型菌株无生长）

三、实验中常见的实验问题

（1）Crispr/Cas9基因敲除和RNAi干扰的对比？

从抑制基因表达的效率上来讲，RNAi是在转录后水平降低基因表达，而Crispr/Cas9则可以靶向DNA并永久改变或敲除基因表达。有些时候可能需要Crispr/Cas9来完全敲除，以免残留的低水平蛋白表达造成任何不确定的影响。从脱靶效应上来讲，由于CRISPR系统必须在转录起始位点附近才能发挥作用，其脱靶效率要远低于RNAi。

（2）敲除成功率低？

原因：gRNA靶向性差或Cas9活性不足、递送系统效率低，编辑工具未有效进入细胞、细胞类型特殊（如原代细胞、干细胞）对编辑不敏感。

解决办法：

优化 gRNA 设计：使用网站设计后优先选择：GC含量40%-60%、无自身二级结构的序列；靶向基因编码区（尤其是N端），确保indel（插入/缺失）能导致移码突变；避开单核苷酸多态性（SNP）区域，避免因序列差异降低结合力。

提高Cas9活性与表达：选择与细胞类型匹配的启动子（如真核细胞用CMV、EF1α，原核用T7）。

四、技术对比