摘要：中国农业科学院烟草研究所宋士健特聘研究员与韩国浦项工科大学Inhwang Hwang教授合作，成功鉴定并敲除本氏烟草（Nicotiana benthamiana）的两个主效多酚过氧化酶（PPO）基因，构建了“清洁型”烟草植物底盘。该研究突破了长期制约植物分子农

中国农业科学院烟草研究所宋士健特聘研究员与韩国浦项工科大学Inhwang Hwang教授合作，成功鉴定并敲除本氏烟草（Nicotiana benthamiana）的两个主效多酚过氧化酶（PPO）基因，构建了“清洁型”烟草植物底盘。该研究突破了长期制约植物分子农业（Plant molecular farming）发展的纯化瓶颈，为以烟草为底盘的植物源重组蛋白药物的高效制备提供了新的解决方案。研究成果《Knocking out two polyphenol oxidase genes significantly improves recombinant protein purification inNicotiana benthamiana》于2025.9.22上线预印本平台(https://doi.org/10.1101/2025.09.21.677675)。

近年来，合成生物学作为战略性新兴产业的核心领域之一，在全球范围内快速发展，并在药物、农业和材料等方向展现出广阔应用前景。植物分子农业作为合成生物学的重要分支，利用植物作为生物反应器生产高附加值重组蛋白，逐渐成为国内外研究与应用的热点。

然而，植物特有的次生代谢产物，尤其是多酚类化合物，在提取和纯化过程中容易与目标蛋白结合，诱发严重的酶促褐变和蛋白聚沉。这不仅导致纯化效率低、产品纯度不足，还使得下游纯化成为该领域的主要技术瓶颈。据报道，植物源重组蛋白药物的下游纯化成本可占总成本的80%。

该研究通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术从本氏烟草PPO候选基因中鉴定到两个主效基因，PPOa和PPOb。随后，通过CRISPR-Cas9技术成功获得两个双突株系ppoa;ppob和ppoa;ppob，双突株系的蛋白粗提液不再发生酶促褐变和蛋白聚沉现象（图1）。

图1 本氏烟草主效多酚过氧化酶的筛选及鉴定

随后，选取ppoa;ppob与WT对比进行功能验证，新冠病毒刺突蛋白三聚体的纯化回收率提升约70%，流感病毒血凝素三聚体的回收率提升约40%。进一步的蛋白质组学与代谢组学分析证实，PPO介导的酶促反应是导致蛋白聚沉和内源蛋白污染的关键原因。与WT相比，突变植株中的高分子复合物（High-molecular complex）大幅减少，内源蛋白的污染率从63.4%降低到3.2%，以绿原酸及其异构体为主的残留多酚含量显著下降（图2）。

图2 Spike和HA三聚体在PPO双突中的纯化得率和质量显著提升

该研究提供了直接的遗传学与生化证据，通过构建通用的“纯净型”烟草植物底盘，从根源上解决了困扰该领域40余年的重组蛋白纯化难题（图3），为各类重组蛋白药物的高效制备提供了重要支撑，有效赋能以本氏烟草为底盘的植物分子医药的基础研究和产业化应用。

图3 “清洁型”烟草植物底盘的高效纯化机制

为进一步推动国内以烟草为底盘的植物分子医药及植物合成生物学的研究进展，并加速相关技术在科研中的应用，团队决定向非商业用途开放ppoa;ppob 株系的使用许可。对该株系有研究需求的研究团队，可联系宋士健（songshijian@caas.cn）签署材料转让协议（MTA）获取种子。此举旨在促进科研共享与合作，加快植物底盘优化技术在疫苗和重组蛋白研究中的应用推广。

通讯作者简介：

Inhwan Hwang，韩国浦项工科大学教授，于北卡罗来纳大学获得博士学位，于哈佛大学开展博士后研究。2015年获得韩国最佳生物学奖，2016年获得韩国总统科技奖，同时入选韩国翰林院院士，主要从事细胞重编程、细胞内物质转运、植物反应器等方面的研究。先后创办BioApp、BioCOM 、BioIN三家企业，分别聚焦兽用疫苗、环保酶、胰岛素等植物源重组蛋白制品的开发及应用。其中，BioApp公司已获批经典猪瘟和猪圆环2两款植物源兽用疫苗上市，是目前全世界范围内唯一仍在售的两款植物源疫苗产品，公司在资本市场推进到Pre-IPO阶段。

宋士健，2017年于山东农业大学张彦教授实验室获得硕士学位，2021年于韩国浦项工科大学Inhwan Hwang教授实验室获得博士学位。随后，分别在浦项工科大学、牛津大学、香港中文大学从事博士后研究，于2024年入职中国农业科学院烟草研究所，担任特聘研究员。聚焦植物合成生物学使能技术开发、高效烟草植物底盘改造、植物源重组蛋白疫苗的研究及应用等相关工作。获批6项PCT国际专利，其中4项完成成果转化，相关专利涉及产品经典猪瘟和猪圆环2两款植物源兽用疫苗已在韩上市。

来源：富翔科学论