摘要：想象一下，你正试图在一场盛大烟火表演的璀璨光芒中，寻找一颗特定颜色的、一闪而过的微弱流星。这几乎是一项不可能完成的任务。烟火的绚烂背景，就像巨大的噪声，将你真正想要观测的信号，那颗流星，完全淹没。
想象一下，你正试图在一场盛大烟火表演的璀璨光芒中，寻找一颗特定颜色的、一闪而过的微弱流星。这几乎是一项不可能完成的任务。烟火的绚烂背景，就像巨大的噪声，将你真正想要观测的信号，那颗流星，完全淹没。
在微观世界里，研究人员们每天都在面对类似的挑战。他们渴望追踪细胞内一个至关重要的角色，信使RNA(mRNA)。这些分子如同细胞内的“信使”，携带着生命的蓝图，从细胞核的“中央档案馆”出发，精准地去往细胞质的“工厂”，指导蛋白质的合成。一个mRNA分子身在何处、去往何方、何时被翻译，这些时空信息，决定了细胞的命运，从细胞的正常生长、分化，到神经元之间突触的形成，乃至癌症的发生发展。能够亲眼“看”到单个mRNA分子的动态旅程，是解开无数生命之谜的关键。
然而，想要看清它，我们必须先给它“点亮”。常规的方法是利用一种源自噬菌体的“分子夹子”，MS2外壳蛋白(MS2 coat protein, MCP)，它能特异性地结合mRNA上被人工插入的MS2发卡结构。再给这个“夹子”拴上一个荧光蛋白，当它夹住mRNA时，我们就能通过显微镜看到一个移动的亮点。但这套系统有个致命的缺陷：细胞内充满了大量未结合到mRNA上的、游离的荧光“夹子”。它们像弥漫的荧光“迷雾”，大大降低了信噪比(signal-to-noise ratio)，使得真正附着在单个mRNA上的微弱信号，就如同烟火下的流星，难以辨认。
为了拨开这层“迷雾”，研究人员们想尽了办法。但这些方法往往伴随着新的妥协。那么，有没有一种更巧妙的策略，能够让探针只在“执行任务”时发光，而在“游离”状态时，就自动“消失”呢？
9月22日，《Nature Methods》的研究报道“RNA-stabilized coat proteins for sensitive and simultaneous imaging of distinct single mRNAs in live cells”，为我们带来了令人振奋的答案。研究人员开发出了一套全新的RNA成像工具，它如同拥有了“智能识别”系统，只有在与目标RNA结合时才能稳定存在，一旦脱离目标，就会被细胞内的“清洁工”，蛋白酶体(proteasome)，迅速降解。这种“不结合，即降解”的策略，从根本上消除了背景噪声，让单个mRNA分子的身影在活细胞中前所未有地清晰起来。
要理解这项新技术的突破性，我们先来看看旧方法的“痛点”。经典的MS2/MCP系统，已经在RNA生物学领域服役了二十多年。它的原理直观而强大：在你想研究的mRNA序列上，串联插入多个（通常是24个）MS2 RNA发卡结构，就像给这封“信件”贴上了一排醒目的“邮票”。同时，在细胞内表达与荧光蛋白融合的MCP蛋白，这个蛋白会像一个忠诚的“邮递员”，特异性地识别并结合这些“邮票”。如此一来，一个mRNA分子就会被多个荧光蛋白标记，形成一个足够亮的荧光斑点，从而可以被显微镜捕捉到。
这个系统很美妙，但现实很骨感。为了确保每一个mRNA上的“邮票”都能被“邮递员”及时找到，我们通常需要在细胞内表达过量的MCP蛋白。这意味着，在任何时刻，细胞质中都漂浮着海量的、未结合到任何mRNA上的荧光MCP蛋白。它们均匀地散布在细胞中，形成了一片挥之不去的荧光背景。当你想观察的单个mRNA信号本就微弱时，这片背景就成了致命的干扰。这就好比在一间灯火通明的房间里寻找一根点燃的火柴，难度可想而知。
过去的优化策略，更像是一种“扬汤止沸”。其中一种主流方法是给MCP蛋白加上一个核定位信号(Nuclear Localization Signal, NLS)。这个信号会把所有游离的MCP蛋白都“骗”到细胞核里关起来。这样，细胞质的背景就干净了，成熟的mRNA从细胞核出来后，就能在相对“黑暗”的细胞质中被看清。
这种“眼不见为净”的策略确实在一定程度上提升了细胞质中的信噪比，但它也带来了新的问题。首先，它牺牲了观察细胞核内RNA的能力。细胞核是RNA生命周期的起点，转录、剪接等关键事件都在这里发生。当细胞核被高浓度的游离探针填满时，我们就无法分辨哪些是真正结合在新生RNA上的信号，哪些只是背景。其次，这种方法依赖于细胞核与细胞质的物理隔离，对于一些没有细胞核的原核生物，或者当我们需要研究核内RNA的动态时，它就无能为力了。
其他一些技术，如依赖RNA适配体(aptamer)的系统，虽然能实现RNA依赖性的荧光，但它们通常需要外源添加染料小分子，操作更为复杂，且染料的亮度和稳定性也可能受限。
归根结底，这些方法都没有触及问题的核心：如何让探针本身变得“智能”？理想的探针应该具备一种内在的开关机制，只有在找到并结合目标RNA的那一刻，它的荧光信号才被“激活”并“稳定”下来。这正是新研究所要解决的根本问题，他们选择的不是“遮蔽”背景，而是从源头上“消除”背景。
研究人员的思路非常直接：给MCP蛋白装上一个“自毁”开关。在蛋白质的世界里，这个开关被称为“降解决定子”(degron)。它是一段短小的氨基酸序列，一旦暴露出来，就会被细胞内的泛素-蛋白酶体系统识别，如同被贴上了一张“待销毁”的标签，随后蛋白质就会被迅速降解。
他们的核心构想是：将这个degron巧妙地置于MCP蛋白的某个位置，使得当MCP蛋白处于游离状态时，degron是暴露的，蛋白被降解，荧光背景消失；而当MCP蛋白结合到MS2 RNA发卡上时，RNA分子本身或者结合后引起的蛋白构象变化，能够恰好“遮蔽”或“掩盖”这个degron，保护其免受降解。这样一来，只有结合了RNA的MCP蛋白才能稳定存在并发出荧光。
这个想法听起来天衣无缝，但实施起来却面临一个巨大的结构生物学障碍。天然的MCP蛋白，其N端和C端都远离其与RNA结合的核心区域。这意味着，无论你把degron拴在蛋白的哪一端，RNA都“鞭长莫及”，无法提供有效的遮蔽。
为了克服这个难题，研究人员采取了一个极具创造性的两步策略：
第一步：移花接木，用“环化重排”创造新的蛋白末端
他们运用了一种名为“环化重排”(circular permutation)的蛋白质工程技术。想象一下，你有一根完整的皮带，搭扣和尾端相距最远。现在，你把皮带中间的一部分（比如靠近RNA结合的区域）剪开，形成一个新的“头”和“尾”，然后再把原来旧的头和尾缝合起来。这样，你就得到了一根拓扑结构相同但开口位置完全不同的新皮带。
研究人员正是对MCP蛋白进行了这样的“手术”。他们将原本的N端和C端通过一个柔性接头连接起来，然后在靠近RNA结合界面的一个环状结构(EF loop)上切开，创造出了一对全新的N端和C端。这个新“C端”的位置，恰好紧邻着MS2 RNA发卡“挤”进来的地方。他们将这个经过改造的蛋白命名为`cpMCP` (circularly permuted MCP)。实验证明，这个“手术”非常成功，`cpMCP`保留了与MS2 RNA高效结合的能力。
第二步：精准“埋雷”，优化degron的位置
有了这个紧邻RNA结合位点的新C端，研究人员终于可以“埋雷”了。他们选择了一个被充分研究过的、由四个氨基酸组成的C端degron（-RRRG序列）。他们将这个degron接在了`cpMCP`的新C端上，得到了第一个不稳定的探针版本`dMCP-S52`(destabilized MCP)。
然而，蛋白质工程的魅力在于细节。degron与蛋白主体的距离、柔性、以及周围的化学环境，都会极大地影响其被蛋白酶体识别的效率。一个好的“自毁”探针，不仅要在游离时降解得足够快，还要在结合RNA后稳定得足够好。为了找到最佳的平衡点，研究人员进行了一轮精细的“微调”。他们通过逐个删除新C端末端的氨基酸，来改变degron与蛋白质核心的相对位置，生成了一系列变体，如`dMCP-S51`、`dMCP-Q50`、`dMCP-R49`等。
为了定量评估这些变体的性能，他们设计了一个巧妙的筛选系统。他们构建了一个能同时表达两个蛋白的质粒：一个是待测的、与红色荧光蛋白mScarlet融合的dMCP变体；另一个是作为内参的绿色荧光蛋白mNeonGreen（mNG）。通过流式细胞术，可以精确测量单个细胞内红/绿荧光的比值，这个比值直接反映了dMCP变体的稳定水平。
激动人心的结果出现了。当这些探针在没有表达MS2 RNA的细胞中表达时，它们的荧光水平均非常低，说明“自毁”程序运行良好。而当它们与含有24个MS2发卡的mRNA共表达时，奇迹发生了。其中，`dMCP-Q50`变体的表现最为出色：其蛋白水平在MS2 RNA存在的情况下，飙升了整整63倍！而与此同时，它在没有MS2 RNA时的背景水平依然保持在极低的水平。这个巨大的动态范围，意味着一个极其灵敏的“开关”被成功制造出来了。后续的实验也证实，dMCP的降解确实是通过蛋白酶体途径实现的，并且与MS2 RNA的结合能够显著延长其在细胞内的半衰期，从快速降解变为长达数小时的稳定存在。
自此，一个被命名为`dMCP`（取destabilized MCP之意）的全新探针，宣告诞生。
研究人员从多个维度对`dMCP`进行了堪称严苛的“能力验证”。
彩虹调色盘：强大的通用性
一个好的工具平台，应该具备极强的兼容性。研究人员将`dMCP`与来自不同谱系、覆盖从青色到远红外光谱的多种荧光蛋白（如mTurquoise2, mNeonGreen, mVenus等）进行了融合。结果显示，无论搭配哪种荧光蛋白，`dMCP`都保持了其RNA依赖性的稳定性。这意味着，研究人员可以根据自己的实验需求（比如进行多色成像），自由地为`dMCP`“换装”。
更有甚者，他们还将`dMCP`与一些非荧光报告蛋白融合，例如可以结合外源染料的HaloTag，以及可以产生生物发光(bioluminescence)的NanoLuciferase(NLuc)。实验结果同样令人满意：HaloTag-dMCP只有在表达MS2 RNA的细胞中，加入染料后才能看到明亮的信号；而NLuc-dMCP的生物发光活性，也表现出了严格的MS2 RNA依赖性。这极大地拓展了`dMCP`的应用场景，从传统的荧光成像，延伸到了超分辨成像、电子显微镜关联成像乃至无需外部光源的生物发光检测。
明察秋毫：灵敏的单分子探测能力
“能看到单个分子”是所有成像技术追求的圣杯。`dMCP`能否担此重任？研究人员将4个mNeonGreen串联起来，与`dMCP`融合（构成`4xmNG-dMCP`），用以标记一个含有24个MS2拷贝的mRNA。在经过优化的共聚焦显微镜下，他们看到了极其清晰、明亮的单个荧光斑点，其在细胞质背景下的信噪比(SNR)高达25。
为了进一步确认这些亮点确实就是mRNA分子，他们动用了单分子RNA成像的金标准，单分子荧光原位杂交(smFISH)，并结合了信号放大技术(Hybridization Chain Reaction, HCR)。结果显示，`4xmNG-dMCP`的荧光信号与smFISH-HCR的信号高度重合，共定位率达到了惊人的92 ± 5%。这有力地证明了`dMCP`标记的准确性和高灵敏度。
更具说服力的是与传统探针的“头对头”比较。在同样的条件下，使用仅有一个荧光蛋白的`1xmNG-dMCP`，其成像信噪比为23.7；而使用传统的、经过核定位优化的探针`1xmNG-NLS-tdMCP`，信噪比仅为11.1。超过两倍的信噪比提升，意味着`dMCP`让原本模糊的信号变得清晰可见，极大地降低了成像的门槛。
攻克堡垒：清晰成像核内RNA
`dMCP`最令人称道的优势之一，便是它解决了传统方法无法有效观察核内RNA的难题。研究人员利用了一个名为MEG3NRE的RNA元件，它可以将mRNA“扣押”在细胞核内一种叫做“核斑”(nuclear speckle)的特殊结构中。
当他们使用传统的`NLS-tdMCP`探针时，整个细胞核都弥漫着强烈的、无处不在的荧光背景，根本无法分辨出哪些信号是与核斑上的mRNA相关联的。然而，当换用`1xmNG-dMCP`后，图像豁然开朗：弥散的核内背景几乎完全消失，取而代之的是与核斑标志物SC35高度共定位的、一个个清晰的荧光点。通过沿着核斑绘制荧光强度剖面线，可以看到`dMCP`的信号峰值与SC35的峰值完美吻合，而`NLS-tdMCP`的信号则是一片混乱的高原，完全淹没了目标信号。这一对比，直观地展示了`dMCP`在攻克高背景区域成像难题时的巨大威力。
拥有了如此强大的新式“显微镜”，研究人员终于可以静静欣赏细胞内那些“隐身信使”的曼妙舞姿了。他们利用`dMCP`对几种命运截然不同的mRNA进行了实时追踪，揭示了它们在活细胞中的动态行为。
他们首先观察了编码组蛋白H2B的mRNA。这种mRNA在细胞质中自由扩散，为细胞核提供组蛋白。在`dMCP`的标记下，研究人员看到了许多快速移动的荧光斑点，在细胞质中进行着布朗运动。通过分析大量的运动轨迹，他们计算出其平均扩散系数约为0.13 µm²/s，这与之前使用其他方法测得的数据高度吻合，验证了`dMCP`不会干扰mRNA的正常运动。
接着，他们将目光投向了编码一种分泌蛋白（LSS-mCherry-KDEL）的mRNA。这类mRNA在翻译开始后，会迅速被引导并“锚定”在内质网(endoplasmic reticulum, ER)的表面，一边翻译，一边将新生的蛋白质“塞”进内质网腔。正如预期的那样，研究人员观察到，标记这些mRNA的荧光斑点绝大多数都是静止的，牢牢地附着在网状的内质网上。
更有趣的是编码线粒体外膜蛋白TOM20的mRNA。理论上，它也可能以内质网定位的方式进行翻译，或者被运输到线粒体附近进行局部翻译。利用`dMCP`，研究人员首次在活细胞中清晰地看到了两类截然不同的动态群体：一部分是几乎不动、锚定在特定区域的静态mRNA；另一部分则是快速移动的动态mRNA。有趣的是，那些静态的mRNA群体，往往聚集在线粒体信号较强的区域，暗示着它们可能正在线粒体表面进行“就地翻译”。
为了验证这些动态行为确实与“翻译”这一生命活动直接相关，研究人员使用了一种翻译抑制剂，哈灵顿碱(harringtonine)。这种药物可以“冻结”核糖体，并导致其从mRNA上脱落。当他们向正在成像的细胞中加入harringtonine后，惊人的一幕发生了：那些原本静止不动的、锚定在内质网和线粒体上的mRNA，瞬间“解放”了，开始像自由的H2B mRNA一样在细胞质中快速扩散。这个实验有力地证明了，`dMCP`不仅能“看见”mRNA在哪里，还能帮助我们推断它在“做什么”。这种将定位信息与功能状态相关联的能力，是`dMCP`作为研究工具的巨大价值所在。
生命过程的复杂性，往往源于不同分子间的协同与互作。如果只能观察一种mRNA，我们看到的永远是独舞。要想理解细胞内复杂的RNA调控网络，比如一个mRNA的定位如何受到另一个非编码RNA的影响，我们就必须具备同时观察两种不同RNA分子的能力。
这要求我们开发出一套与MS2/MCP系统“正交”(orthogonal)的工具，即它有自己的“邮票”和“邮递员”，且两者互不干扰。幸运的是，这样的系统早已存在，源自另一种噬菌体的PP7/PCP系统。
循着创造`dMCP`的成功经验，研究人员着手打造一个不稳定的PCP版本。他们同样运用了环化重排和degron附加策略。虽然过程中遇到了一些蛋白质聚集的技术难题，但通过引入额外的突变增加其溶解性，他们最终成功地创造出了`dPCP`(destabilized PCP)。流式细胞术的测试表明，`dPCP`在结合其靶标PP7 RNA后，蛋白水平能提升约19倍。虽然这个倍数不及`dMCP`的63倍，但已经完全足够用于低背景的单分子成像。
最关键的是正交性测试。当细胞内同时存在`dMCP`、`dPCP`、MS2 RNA和PP7 RNA时，`dMCP`的稳定性只受MS2 RNA的影响，而`dPCP`的稳定性也只依赖于PP7 RNA的存在。两者“各司其职，互不理睬”，一套完美的双色成像系统就此诞生。
研究人员立刻展示了这套系统的威力。在一个巧妙的实验中，他们让细胞同时表达两种RNA：一种是被MEG3NRE元件“扣押”在细胞核的MS2标记mRNA，另一种是能够被输出到细胞质的PP7标记的环状RNA。他们用红色的mScarlet-dMCP标记前者，用绿色的mNG-dPCP标记后者。在显微镜下，一幅泾渭分明的画面出现了：红色的荧光点清晰地聚集在细胞核内，而绿色的荧光点则散布在细胞质中。两种RNA的命运，在同一个细胞里被同时、清晰地呈现出来。
在最终的活细胞双色成像实验中，他们同时追踪了动态的H2B-MS2 mRNA和静态的LSS-PP7 mRNA。在实时录制的视频中，我们可以看到，红色的斑点（代表H2B mRNA）在细胞质中轻快地穿梭，而绿色的斑点（代表LSS mRNA）则安静地停留在内质网的港湾。这一动一静的生命交响乐，在`dMCP/dPCP`这对话筒的收录下，显得无比和谐与清晰。
这项研究为我们提供的，远不止一两个好用的新工具。它更深远的意义在于，它为解决生命科学研究中一个普遍的“信噪比”问题，提供了一种全新的设计哲学，从被动地“隔离”或“隐藏”背景，到主动地、从源头上“消除”背景。这种基于“条件性稳定”的策略，就像给分子探针装上了一个逻辑门，让它变得更加“智能”。
手握`dMCP`和`dPCP`这套高灵敏度、低背景的成像“利器”，一扇通往未知世界的大门正在缓缓打开。过去那些因技术限制而无法触及的生物学问题，如今都进入了我们的视野。
我们可以想象，在神经科学领域，研究人员可以利用它来实时追踪单个mRNA在神经元轴突或树突中的长距离运输，并观察在学习和记忆过程中，这些mRNA的局部翻译是如何被精确调控的。在病毒学领域，我们可以同时标记宿主和病毒的RNA，以前所未有的清晰度观察它们在感染过程中的相互作用和空间争夺。
更令人兴奋的是，这套系统的应用潜力远不止于RNA成像。研究人员在论文中展望，`dMCP`可以与其他功能模块结合，创造出更多强大的工具。例如，将它与CRISPR-dCas9系统结合，可以开发出用于标记基因组特定位点(genomic loci)的、信号更强的探针。将它与一些能催化化学反应的酶（如用于邻近标记的APEX2）融合，可以实现对特定RNA周围蛋白质环境的“快照”式捕捉，并且由于游离探针被降解，脱靶效应将被大大降低。甚至，我们还可以将它与RNA编辑或修饰的酶相结合，构建出只有在结合靶标RNA后才具有活性的“智能药物”，实现对基因表达的精准调控。
科学的每一次飞跃，往往始于我们看得更远、更清。一百多年前，显微镜的发明让我们看到了细胞的存在；几十年前，绿色荧光蛋白(GFP)的发现让我们能够在活细胞中追踪蛋白质的足迹。今天，`dMCP`和`dPCP`的诞生，则为我们递上了一副能够洞察单个RNA分子动态命运的、前所未有的“高清眼镜”。
透过这副眼镜，我们看到的将不再是模糊的迷雾，而是生命在分子尺度下，一场场精心编排的、充满韵律的舞蹈。而我们，正有幸成为这场舞蹈的第一批观众。
参考文献
Kuffner, C.J., Marzilli, A.M. & Ngo, J.T. RNA-stabilized coat proteins for sensitive and simultaneous imaging of distinct single mRNAs in live cells. Nat Methods (2025). https://doi.org/10.1038/s41592-025-02782-4
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来源：生物探索一点号1
