摘要：在生物制药领域，杆状病毒-昆虫细胞表达系统以其高效表达复杂蛋白的能力被广泛应用，尤其适用于疫苗、病毒样颗粒和某些重组蛋白的生产。然而，该系统的产品质量控制尤为复杂，主要涉及翻译后修饰的异质性、宿主来源杂质以及病毒安全性等多个维度。产品质量属性的有效控制不仅直接
在生物制药领域，杆状病毒-昆虫细胞表达系统以其高效表达复杂蛋白的能力被广泛应用，尤其适用于疫苗、病毒样颗粒和某些重组蛋白的生产。然而，该系统的产品质量控制尤为复杂，主要涉及翻译后修饰的异质性、宿主来源杂质以及病毒安全性等多个维度。产品质量属性的有效控制不仅直接影响药物的安全性与有效性，也是监管申报和技术审评的核心关注点。本文将从糖基化修饰差异的精准检测、宿主细胞蛋白残留的多策略控制，以及病毒灭活与去除工艺的系统验证三个关键环节，深入解析其质量控制策略，以期为工艺开发与质量研究提供系统参考。
一、如何精准解析杆状病毒表达产物的糖基化修饰差异？
杆状病毒-昆虫细胞系统虽可完成基本的N-糖基化过程，但其糖型结构通常以高甘露糖型为主，缺乏复杂型糖链和末端唾液酸化，这与哺乳动物细胞表达系统存在显著差异。这种差异可能影响蛋白药物的药代动力学、免疫原性和生物学功能。因此，糖基化异质性的精细解析成为该表达系统质量控制的首要任务。目前，基于高分辨质谱的技术策略已被广泛采用，其关键步骤包括：
1.样品前处理与糖链释放：
通过酶切（如PNGase F）释放N-糖链，并利用固相萃取法进行纯化，以去除肽段和盐类干扰。为提高质谱检测灵敏度，常对糖链进行荧光标记衍生化（如2-AB标记）。
2.质谱分析策略：
MALDI-TOF MS：适用于糖链的快速筛查和分子量分布分析，可初步判断主要糖型类别及其相对丰度。
LC-ESI-MS/MS：结合液相色谱的分离能力与串联质谱的结构解析能力，可深入分析糖链分支模式、糖基组成及修饰状态（如磷酸化、唾液酸化缺失等），提供更精细的糖型定性及相对定量信息。
3.数据解析与生物意义评估：
利用专业数据库（如GlyConnect、UniCarb-DB）和软件工具（如Byonic、GlycoWorkbench）进行糖型鉴定与半定量分析。需特别关注关键质量属性，如高甘露糖型占比、末端半乳糖水平及是否存在免疫原性相关糖表位（如α-1,3-半乳糖）。结合功能实验（如受体结合、血清稳定性）评估糖基化模式对药物效力和安全性的潜在影响。
实际案例表明，某单抗药物在昆虫细胞中表达时因糖基化简单化导致体内半衰期显著缩短，后续通过共表达哺乳动物来源的糖基转移酶优化糖型结构，最终改善药代动力学特性。
二、如何有效控制宿主细胞蛋白残留？
宿主细胞蛋白（HCP）是生产工艺中引入的一类重要杂质，即便在低浓度下仍可能诱发免疫反应或影响产品稳定性，因此其残留控制至关重要。由于杆状病毒-昆虫细胞系统的宿主蛋白组成与哺乳细胞差异显著，常规检测工具可能不适用，需建立覆盖广、灵敏度高的多技术联用策略：
1.ELISA 检测技术：
早期工艺开发中可采用市售通用型HCP检测试剂盒（如针对Sf9或High Five细胞），其定量限可达1–2 ng/mL，适用于快速筛查和批次放行。然而，由于抗体交叉反应性的限制，通用试剂盒可能无法识别所有HCP，尤其在工艺变更后可能出现新杂质。
2.LC-MS/MS 补充分析：
非标记定量蛋白质组学（Label-free Quantification）：能够无偏倚地鉴定和定量样品中数千种蛋白质，尤其适合低丰度HCP（检出限可达ppm级别）的检测，并可建立工艺特异性HSP谱库。
多反应监测（MRM）：针对已知高风险HCP（如蛋白酶、核酸酶或糖苷酶）设计靶向检测方法，实现高灵敏度和重复性的定量监控。
3.整合控制策略：
建议在工艺开发阶段采用LC-MS/MS进行全面杂质谱分析，确定主要HCP种类及其动态变化；在产业化阶段则建立产品特异性ELISA方法用于常规质控。值得注意的是，纯化工艺的优化（如层析条件调整）可能导致HCP种类和水平发生显著变化（某些情况下可升高10–20倍），因此需持续监测并与工艺性能关联分析。
三、如何科学验证病毒安全性与工艺清除能力？
尽管杆状病毒本身仅感染无脊椎动物，不存在人类致病风险，但生产过程可能引入外源病毒污染（如支原体、其他昆虫病毒等）。因此，必须对下游纯化工艺的病毒清除能力进行严格验证，以确保最终产品的生物安全性：
1.病毒指示剂的选择：
根据ICH、FDA及EP相关指南，应选择具有不同物理化学特性的模型病毒，通常包括小型非包膜病毒（如鼠细小病毒MVM）、包膜病毒（如逆转录病毒X-MuLV）以及更大尺寸的DNA病毒（如腺病毒）。其目的是全面评估各类工艺步骤对不同病毒的去污效果。
2.关键单元操作的验证要点：
层析工艺：如阴离子交换层析、亲和层析等，需评估其病毒清除机制（如吸附去除、尺寸排阻），并验证在不同填料、载量及洗脱条件下对模型病毒的清除率（一般要求≥4 log）。
病毒灭活步骤：包括低pH孵育、溶剂/去污剂（S/D）处理、加热灭活等，需明确关键工艺参数（如pH值、温度、时间）的操作范围，并证明其能够稳定、重复地降低病毒滴度。
3.风险评估与持续控制：
若某些工艺步骤经充分验证可稳定达到较高病毒清除率（如≥4 log），则可在后续常规生产中豁免该病毒的检测。对于无法完全清除的潜在污染物（如内源性逆转录病毒样颗粒），需计算累积清除指数（LRV），并结合源头控制（如细胞库检定）及多步清除策略，使最终风险低于可接受限度。
成功案例如某创新单抗药物，通过验证阴离子交换层析可有效去除>4 log的X-MuLV病毒，不仅确认了该步骤的核心纯化地位，也为上市申报提供了关键安全性数据。
结论与展望
杆状病毒-昆虫细胞表达系统在生物制药中具有独特价值，但其产品质量控制是一项多维度、跨学科的系统性工程：糖基化修饰需借助高分辨质谱进行“精细解码”，宿主蛋白残留需依靠ELISA与LC-MS/MS“协同作战”，而病毒安全则须经过“层层验证”以确保持续合规。未来，随着质谱多组学、高通量测序和数字化工艺建模技术的发展，产品质量属性的分析将朝着更高精度、更高通量和更实时化的方向演进，从而进一步推动这一表达系统在复杂生物药开发中的应用。
来源：斯达特生物
