摘要：质粒是一种在细胞的染色体或核区DNA之外能够自主复制的DNA分子，它不仅能在基因工程中作为递送基因信息进行增殖和表达的载体工具，而且在成药领域，高纯度的超螺旋质粒DNA可以作为疫苗或治疗性药物单独使用，也可以作为AAV/LV病毒载体的包装和辅助材料，同时线性化
转自：东富龙
质粒介绍
质粒是一种在细胞的染色体或核区DNA之外能够自主复制的DNA分子，它不仅能在基因工程中作为递送基因信息进行增殖和表达的载体工具，而且在成药领域，高纯度的超螺旋质粒DNA可以作为疫苗或治疗性药物单独使用，也可以作为AAV/LV病毒载体的包装和辅助材料，同时线性化后的质粒DNA也是mRNA疫苗体外转录的模板。因此，快速高效制备高纯度、高质量的超螺旋DNA，始终是基因/细胞治疗药物和DNA/mRNA疫苗企业的重要工作目标。
目前，质粒纯化工艺主要分为“三步法”和“两步法”，它们各有特点，适用于不同的应用场景。
质粒纯化过程
质粒的纯化工艺通常采用三步法或两步法。三步法包括凝胶过滤层析、亲和层析和离子交换层析，两步法包括混合模式层析和亲和层析。在这里，东富龙进行了两步法与三步法的对比。
质粒纯化工艺案例
经典三步法工艺
（1）分子筛层析：去除宿主RNA
（2）亲和层析：去除ocDNA
（3）离子交换层析：去除痕量杂质及内毒素
Step1：Purose 6 Fast Flow
样品：浓缩后样品
载量：0.2-0.3CV
缓冲液：2.1M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
Step2：Rigose PlasmidPure
样品：过Purose 6 Fast Flow后的pDNA
载量：3mg/mL
平衡缓冲液：2M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
洗脱缓冲液：0.3M NaCl，1.7M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl， pH 7.5
Step3：Rigose Q HiRes
样品：按比例稀释的亲和洗脱液 (稀释比：1:2)
载量：1mg/mL
平衡缓冲液：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
洗脱缓冲液：1M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
本案例采用Purose 6 Fast Flow作为分子筛，有效去除宿主RNA和杂蛋白，pDNA收率达92.5%；再利用亲和层析介质Rigose PlasmidPure，高效分辨scDNA和ocDNA，最后用离子层析介质Rigose Q Hires进一步将痕量杂质及内毒素去除。整体纯化工艺后HCD残留7ug/mg，HCP＜1%，总收率在72%，纯度最终可达95%。
两步法工艺
（1）混合模式层析：捕获pDNA，去除内毒素等
（2）亲和层析：去除ocDNA
Step1：Rigose Shell 700
样品：调(NH4)2SO4后的前处理样品
载量：10mg/mL
缓冲液：2.1M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
样品：过Rigose Shell 700后的pDNA
载量：3mg/mL
平衡缓冲液：2M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
洗脱缓冲液：0.3M NaCl，1.7M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl, pH 7.5
本案例采用混合模式层析介质Rigose Shell 700分离pDNA，同时去除内毒素；再利用亲和层析介质Rigose PlasmidPure进一步将ocDNA去除，最终质粒纯度为95.2%，收率达88%。
两步法与三步法对比
表1. 两步法与经典三步法纯化方法制备
超螺旋质粒DNA结果对比
表2. 两步法与经典三步法纯化方法硫酸铵溶液用量、
工艺时间和填料价格对比结果表
以20L发酵规模计算，采用Rigose Shell 700替代Purose 6 FF后，上样载量从0.3 CV大幅提升至13CV，增幅达43倍，Rigose Shell 700有着更高的上样量、更快的流速与回收率优势，这也将大大提高质粒纯化工艺的效率，两步法的层析工艺时间缩短了近65%。并且由于层析柱尺寸的减小，与Purose 6 FF分子筛的低上样量相比，Rigose Shell 700硫酸铵的消耗量减少了7倍，整个两步法工艺流程的硫酸铵用量比三步法降低了近50%。此外，两步法在填料成本上也比三步法节省了50%。因此，两步法纯化技术在经济效率方面具有显著优势。
然而，两步法在上游发酵和纯化前处理工艺方面提出了较高的要求，需特别关注其可操作性和通用性。目前，市场上已有多种成熟的质粒三步法工艺，能够快速实现工艺的标准化，确保质粒产品的质量符合要求，适合作为项目的初始工艺。但是，在裂解和超滤工艺稳定的前提下，也可以考虑采用创新的两步法，以减少工艺步骤，简化生产操作。
*本文所引用的所有数据均来自东富龙，且均在特定实验条件下获得，仅供参考，实际效果可能因实验条件的不同而有所差异。
其他sc-pDNA纯化工艺分享
工艺二到工艺五为基于沉淀法去除RNA的两步法工艺设备流程图，一些复合模式的填料也表现出了比较新颖的应用，Rigose shell 700同时具有Purose 6 FF和Rigose Q Hires的功能，且采用流穿模式进行纯化，因此具有高的处理通量，结合疏水层析或亲和层析，可作为新的两步法工艺路线模式。表3列举了五种工艺路线的总结，可根据项目具体情况灵活选择。
表3. 质粒工艺汇总表
表4. 产品信息
结语
秉持“服务生物医药，品质铸就双赢”宗旨和理念，始终将服务客户放在第一位。我们具备为生物制药客户提供大规模填料产品和完整技术支持的能力，无论是对接客户工艺的性能验证，还是产品的稳定性验证，本工艺相关技术人员都能够为客户提供全方位的服务。同时，本工艺相关层析介质可提供包括产品说明书、质检文件COA、法规文件RSF（Regulatory Support File）等一系列文件体系，为生物药物的验证和报批提供有利的支持。
来源：新浪财经