摘要：SiR-微管蛋白基于硅罗丹明（SiR）荧光团和微管结合药物多西他赛。SiR-微管蛋白能够以高特异性和低背景在活细胞中标记微管（1）。SiR-微管蛋白的关键特性包括：i）远红光吸收和发射波长；ii）细胞通透性；iii）荧光生成特性；iv）与超分辨率显微镜（STE

SiR-微管蛋白基于硅罗丹明（SiR）荧光团和微管结合药物多西他赛。SiR-微管蛋白能够以高特异性和低背景在活细胞中标记微管（1）。SiR-微管蛋白的关键特性包括：i）远红光吸收和发射波长；ii）细胞通透性；iii）荧光生成特性；iv）与超分辨率显微镜（STED和SIM）的兼容性。这些特性在一个探针中的独特组合使SiR-微管蛋白处于卓越的前沿。

艾美捷SiR-微管蛋白试剂盒（#CY-SC002）物理特性：

吸收波长（λabs）：652 nm

发射波长（λem）：674 nm

652 nm处的摩尔吸光系数（ε）：1.0×10⁵ mol⁻¹·cm⁻¹

分子量（MW）：1303.6 g/mol

分子式（MF）：C73H86N4O16S

储存与操作：

收到后将化合物储存于-20°C以下。使用无水DMSO配制化合物溶液。使用后将化合物溶液储存于-20°C以下。在打开前，应将小瓶恢复至室温。如果储存得当，化合物应可在数月内保持稳定。注意：DMSO溶液应特别小心处理，因为DMSO已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关的当地规定处理这些试剂。

标记协议：

注意：本协议是使用贴壁于盖玻片的人类成纤维细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到验证。实验协议的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。SiR-微管蛋白基于微管稳定药物多西他赛，因此可以改变活细胞中微管的动态。尽管间期细胞受探针影响较小，但在培养的HeLa细胞中，超过100 nM的SiR-微管蛋白浓度会导致有丝分裂期延长（1）。如果计划进行长期成像实验且微管动态至关重要，建议将SiR-微管蛋白的浓度保持在100 nM或以下。对于其他用途，建议使用1 µM的SiR-微管蛋白进行染色。

1. 配制1 mM储备液：将SiR-微管蛋白小瓶的内容物溶解在50 µL无水DMSO中，制备1 mM储备液。该溶液应储存于-20°C或更低温度。不要将溶液分装成小份，因为它们会更快降解，且该化合物不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，该储备液应可在三个月或更长时间内保持稳定。如果需要准确测定储备液的浓度，可将1 µL 1 mM储备液稀释在99 µL含有0.2% SDS的PBS中。在室温下静置15分钟后，在652 nm处测量吸光度。使用上述给定的消光系数计算浓度。

2. 配制染色液：在细胞培养基（例如DMEM + 10%胎牛血清）中将SiR-微管蛋白稀释至所需浓度，并短暂涡旋。由于染色效率可能因细胞系而异，建议首次尝试时使用1 µM浓度以快速获得强染色效果，然后在后续实验中降低SiR-微管蛋白浓度，直至获得最佳染色效果（参见下表中的标记浓度和孵育时间）。某些细胞系可能表达高水平的外排泵，因此SiR-微管蛋白染色效果较差。在染色液中加入10 µM维拉帕米（一种广谱外排泵抑制剂）通常可以显著改善染色效果。

3. 细胞准备和染色：按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润环境中孵育，并根据标记时间作为探针浓度的函数。

*标记时间是针对人类成纤维细胞确定的，可能会因使用的细胞系而有所不同。

重要提示：SiR-微管蛋白不能染色用甲醛（PFA）和甲醇固定的细胞，因为这些固定方法会改变微管上探针的结合位点。

细胞成像：使用标准Cy5设置对SiR-微管蛋白进行成像效果最佳。标记后，活细胞可以立即成像，无需洗涤步骤。可选地，用不含探针的新鲜培养基替换一次标记液通常可以提高信噪比。如果进行时间序列成像，建议在整个实验过程中将探针浓度保持在100 nM或以下，以获得稳定的信号并避免探针干扰微管动态（延长有丝分裂期和降低细胞增殖）。如果在成像前对细胞进行了洗涤，染色效果将持续数小时。

文献参考：

1. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton, G. Lukinavičius et al., Nature Methods, 11, 731–733 (2014)

来源：科学旁观者