牛骨胶原蛋白肽-钙螯合物促成骨活性研究

摘要：牛骨主要由骨髓、骨质和骨膜三部分组成（郑娅等，2013），包含蛋白质、脂肪、钙盐、磷酸盐等无机盐、硫酸软骨素以及水分等。牛骨中的有机相含有丰富的蛋白质，而无机相则富含钙、磷等元素，这些成分含有人体所需的多种氨基酸和微量元素，而软骨素和骨胶原等营养成分则主要存

本文通过建立 MC3T3-E1 成骨细胞体外模型，阐明了牛骨胶原蛋白肽-钙螯合物的促成骨活性及其潜在机制。

牛骨主要由骨髓、骨质和骨膜三部分组成（郑娅等，2013），包含蛋白质、脂肪、钙盐、磷酸盐等无机盐、硫酸软骨素以及水分等。牛骨中的有机相含有丰富的蛋白质，而无机相则富含钙、磷等元素，这些成分含有人体所需的多种氨基酸和微量元素，而软骨素和骨胶原等营养成分则主要存在于骨髓和软骨中（郑娅等，2013；阮孝慈等，2017；RANI et al., 2017）。此外，牛骨富含矿物质，可以通过加工制成食品添加剂或将其制备为具有生物活性的羟基磷灰石的材料。

骨重建是骨形成（成骨细胞负责）与骨吸收（破骨细胞负责）的动态平衡过程，当骨吸收速率大于骨形成速率时容易导致骨质疏松症，因此成骨细胞负责的骨形成非常重要。YE 等人（2019）从牛骨胶原蛋白水解物中分离并鉴定出促成骨细胞活性的胶原蛋白肽并基于细胞实验和动物实验探究了其潜在机制。

本课题组前期研究证实牛骨胶原蛋白肽（bovine bone collagen peptidesCPs）具有抗骨质疏松、促成骨细胞增殖、抑制骨丢失的生物活性（叶孟亮等，2019），这表明牛骨可能是一种天然功能活性成分的良好来源，其中牛骨胶原蛋白肽可作为一种实现高效钙吸收的潜在肽来源。

肽-钙螯合物

研究表明，相比于其他补钙制剂而言，肽-钙螯合物具有促进机体对钙吸收和提高生物利用度的能力，且对胃肠道没有副作用影响。

基于钙结合能力，从牛骨胶原水解物中筛选出了一种新的钙结合肽（Phe-Gly-Leu, FGL）。FGL 的潜在钙结合位点主要包括羰基、氨基、羧基和苯环。Phe-Gly-Leu-Ca 的结构是钙离子被Phe-Gly-Leu 通过配位键和离子键包围并位于中心。此外，FGL-Ca的钙透析百分比优于 CaCl2、CaCO3、乳酸钙和葡萄糖酸钙，并且 FGL-Ca 具有较好的钙吸收转运活性。

体外模拟消化是膳食营养研究中应用最广泛的模型，是一种成熟的、可重复的评估矿物质生物利用度的方法。透析百分比提供了肠腔中可用于吸收（生物利用度）的钙含量的一些信息。高透析性与更好的生物利用度正相关（WANG et al., 2021）。因此，采用体外消化法评价了 CaCl2、CaCO3、乳酸钙、葡萄糖酸钙和 FGL-Ca 的生物利用度差异。

如图 3-8B 所示，FGL-Ca 的钙透析率（56.33 ±0.92%）明显高于其他钙补充剂。这与之前的研究结果一致，即肽-钙复合物具有更高的生物利用度（QU et al., 2022）。这表明 FGL-Ca 可能更容易被肠道吸收。这可能是因为 FGL-Ca减少了钙沉淀，从而提高了其生物利用度。FGL-Ca 具有良好的透析性，表明 FGL-Ca 可能具有良好的生物利用度，具有作为钙补充剂的巨大潜力。

目前，探究肽-钙螯合物的吸收利用效果一般以 Caco-2 细胞作为钙吸收和钙转运的细胞模型。作为一种人结肠癌上皮细胞系，Caco-2 细胞被广泛用于人体肠道吸收药物和其他化合物的模型（RICHARD et al., 2005）。在普通培养条件下该细胞系能自发地分化出小肠绒毛面基底侧和顶侧，并它的细胞极性、紧密性、水解酶系和各种营养物质转运载体与小肠上皮细胞相同，因此被广泛用于模拟体内钙转运和钙吸收的实验。

如图 3-9B 所示，不同剂量的 FGL-Ca 处理组和 CaCl2 处理组在 Caco-2 细胞单层上的钙转运活性高于对照组（P 上述结果表明，FGL-Ca具有较好的促进肠道钙吸收的作用。

成骨活性

骨形成过程主要涉及四个步骤：成骨细胞增殖、成骨细胞分化、成骨细胞矿化和成骨细胞凋亡（SONG et al., 2021）。

钙敏感受体（CaSR）是 C 类 G 蛋白偶联受体（GPCR），通过监测细胞外部 Ca2+浓度水平调节 Ca2+稳态。本文以 TCR 为阳性对照组，探讨 FGL 与 CaSR 的相互作用。FGL 对接 CaSR 得到的-CE 值大于TCR 对接 CaSR 得到的-CE 值。这表明 FGL 有可能自发进入 CaSR 的 VFT 结构域。这表明 FGL可能是 CaSR 的正变构激活剂，这与 GUO 等人（2020）的研究结果一致，即富含芳香族氨基酸的多肽可能具有激活 CaSR 的潜力。随后的 qPCR 和 Western blot 实验也证实了上述推测。因此，FGL-Ca 表现出激活 CaSR 进而提高细胞内钙浓度水平的潜在能力。

细胞外基质（extracellular matrix, ECM）分泌前在成骨细胞内合成，并在细胞增殖、分化和矿化等成骨过程中起着至关重要的作用（TAUBENBERGER et al., 2010）。结果表明，FGL-Ca 可显著促进 COLⅠ的表达。COLⅠ是细胞外基质的主要成分，为骨基质矿化提供支架。这些发现与之前的研究结果一致（WU et al., 2020）。

碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）是一种同源二聚体蛋白，是骨形成过程中必不可少的酶，是成骨细胞增殖、分化和成熟的早期标志。此外，它是骨形成和代谢过程中的重要表型标记物（PENG et al., 2018; SAMITH et al., 2018）。因此，ALP 活性强度是评价成骨细胞分化和矿化的重要指标。

骨保护素（OPG）是 TNF 受体家族的一员，与RANK 竞争 RANKL 作为诱饵受体。因此，OPG 是体外破骨细胞成熟和活化的有效抑制剂。

研究表明，骨钙素（OCN）的水平可以直接反映成骨细胞的活性，也是骨形成或骨转化的特异而敏感的指标（KELLY et al., 2018）。结果表明，FGL-Ca 可显著促进上述基因和蛋白的表达，从而增强成骨活性。

FGL-Ca 能显著增强 MC3T3-E1 细胞的成骨活性（包括增殖、分化和矿化活性）。其潜在机制是 FGL-Ca 可激活 CaSR 以增加细胞内钙离子浓度，诱导 TGF-β1 分泌并激活 TGF-β1/Smad2/3通路，进而增强 MC3T3-E1 细胞成骨活性。

总结

牛骨胶原蛋白肽-钙螯合物促MC3T3-E1细胞成骨活性及其潜在机制 FGL-Ca显著增强MC3T3-E1细胞的成骨活性（增殖、分化和矿化）。

钙荧光标记和分子对接结果表明，FGL-Ca可能激活了Ca SR，导致细胞内钙浓度升高，进而增强MC3T3-E1细胞的成骨活性。进一步研究发现，FGL-Ca可显著促进Ca SR、TGF-β1、TβRII、Smad2、Smad3、OCN、ALP、OPG、COLⅠ的m RNA和蛋白表达水平。随后，在信号通路干预实验中，FGL-Ca促进TGF-β1/Smad2/3信号通路相关基因和蛋白的表达水平下降。

上述结果表明，FGL-Ca可能通过激活Ca SR提高细胞内钙浓度，进而激活TGF-β1/Smad2/3信号通路，这可能是FGL-Ca促成骨活性的潜在机制之一。

参考文献：

齐立伟.牛骨胶原蛋白肽-钙螯合物的结合机制及其促成骨活性研究[D].中国农业科学院,2023.DOI:10.27630/d.cnki.gznky.2023.000308.