Cell | 人工设计蛋白肽逆转与心律失常以及癫痫相关的钠离子通道功能障碍

摘要：离子通道就像是“自然的晶体管”【1】，控制细胞电信号传导，对神经、肌肉等可兴奋细胞的功能至关重要，其功能异常与心律失常、癫痫等多种危及生命的疾病密切相关【2-3】。钠离子通道功能获得性突变（ Gain-of-Function ，GoF）会导致失活机制

撰文|亦

离子通道就像是“自然的晶体管”【1】，控制细胞电信号传导，对神经、肌肉等可兴奋细胞的功能至关重要，其功能异常与心律失常、癫痫等多种危及生命的疾病密切相关【2-3】。钠离子通道功能获得性突变（ Gain-of-Function ，GoF）会导致失活机制受损，钠电流持续性产生，破坏钠离子稳态，引发恶性循环，如Naᵥ1.5中GoF突变与心律失常性长QT综合征3型（LQT3）和房颤相关【4】，Naᵥ1.6中GoF突变与严重发育性癫痫及癫痫突然意外死亡相关【5】。现有治疗中，小分子抑制剂缺乏特异性，天然调节蛋白分子量大、效价低，且对某些突变效果不佳。近年来，基于机器学习的蛋白质设计方法大幅提升从头设计蛋白质的准确性和计算效率，为设计高特异性离子通道调节剂提供了新可能。

近日，来自哥伦比亚大学生理学与细胞生物物理学系的Manu Ben-Johny团队在Cell上发表了题为De novo design of a peptide modulator to reverse sodium channel dysfunction linked to cardiac arrhythmias and epilepsy的文章。利用计算蛋白质设计平台，从头设计并验证了一种名为ELIXIR的21个氨基酸短肽，同时实现了高亲和力与特异性结合。

作者首先基于结构生物学见解设计一种肽分子，主要的机制假设是 Naᵥ通道的失活门（IG，III-IV linker）在失活过程中，需要先从其与羧基末端结构域（CTD）上的EF-hand样区（EFL）的结合中释放出来，才能前移并阻塞孔道。在病理状态下，IG与EFL结合过紧，无法有效阻塞孔道，导致。因此，设计一个肽来竞争性地将IG从EFL上置换下来，应能促进失活，减少/ NaL 。于是他们使用 ColabDesign 框架和“肽幻觉”（peptide hallucination）算法，以Naᵥ1.5 CTD的结构（PDB: 4DCK）为靶点，从头设计了一个21个氨基酸的肽。通过计算模型结合实验，验证了一个能特异性结合Naᵥ1.5 CTD的全新肽分子 ELIXIR 。

接下来作者对ELIXIR的功能性进行验证。利用细胞贴附式多通道记录技术，作者发现ELIXIR对野生型Naᵥ1.5的基础 / NaL 几乎没有影响，而对于突变体Δ1864，ELIXIR共表达可使其 / NaL 降低超过12倍，效果优于经典药物雷诺嗪（约降低4倍），说明ELIXIR能有效抑制由CTD突变引起的病理性 / NaL 。随后，作者开始探索LIXIR是否对由多种不同机制引起的 / NaL 都有效。他们在不同位点的突变模型中进行测试，发现无论是 LOT3相关突变、心房颤动相关突变还是engineered突变，ELIXIR能有效逆转所有情况下的 / NaL 升高，这说明 ELIXIR的作用具有广谱性，能纠正由多种分子缺陷（突变、磷酸化）导致的Naᵥ1.5功能异常，表明其通过一个共同的最终通路（IG释放）发挥作用。

那么 ELIXIR的特异性如何呢？作者探究了ELIXIR对其他Naᵥ亚型的选择性，发现对野生型的Naᵥ1.1, Naᵥ1.4, Naᵥ1.6, Naᵥ1.7通道，ELIXIR均不显著影响其基础 / NaL 。而对致病突变体（如Naᵥ1.4上的F1698I突变、Naᵥ1.6上的N1768D突变），ELIXIR都能逆转 / NaL 升高。这说明 ELIXIR展现出“致病状态选择性”，它能结合多种Naᵥ亚型，但只在通道失活机制本身出现缺陷时才发挥显著的调控作用。进一步地，作者对ELIXIR在更复杂的生理环境下治疗疾病的潜力进行了探索。结果显示，癫痫小鼠模型中， ELIXIR不仅能分子层面抑制电流，更能在组织层面挽救由Naᵥ1.6突变引起的功能性神经元异常。获得性心脏病模型中，ELIXIR能有效逆转由获得性病理 remodeling（磷酸化）引起的心肌电生理异常。最后，在最接近人类疾病的模型——LQT3患者来源的诱导多能干细胞分化的心肌细胞（iPSC-CMs）中，长期表达ELIXIR均能安全有效地逆转由Naᵥ1.5突变引起的关键电生理缺陷，为其最终的临床转化提供了最强有力的实验依据。

总的来说，文章首次将深度学习辅助的蛋白质“幻觉设计”（hallucination）策略应用于离子通道调节剂的开发。机制上，不同于传统小分子药物直接阻塞孔道或作用于电压传感域，ELIXIR靶向通道胞内的CTD调节中心。ELIXIR展现出对“功能异常”通道的偏好性。它主要作用于那些失活机制已经受损的通道，而对正常运作的野生型通道干扰很小，是前景非常广阔的候选治疗分子。

制版人：十一

参考文献

1. Sigworth, F.J. (2003). Structural biology: Life’s transistors.Nature423, 21–22. https://doi.org/10.1038/423021a.

2. Bennett, P.B., Yazawa, K., Makita, N., and George, A.L., Jr. (1995). Molecular mechanism for an inherited cardiac arrhythmia.Nature376, 683–685. https://doi.org/10.1038/376683a0 .

3. Kaplan, D.I., Isom, L.L., and Petrou, S. (2016). Role of Sodium Channels in Epilepsy. Cold Spring Harb.Perspect. Med.6, a022814. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a022814.

4. Wang, D.W., Yazawa, K., George, A.L., Jr., and Bennett, P.B. (1996). Characterization of human cardiac Na+ channel mutations in the congenital long QT syndrome.Proc. Natl. Acad. Sci. USA93, 13200–13205. https://doi.org/10.1073/pnas.93.23.13200.

5. Veeramah, K.R., O’Brien, J.E., Meisler, M.H., Cheng, X., Dib-Hajj, S.D., Waxman, S.G., Talwar, D., Girirajan, S., Eichler, E.E., Restifo, L.L.,et al. (2012). De novo pathogenic SCN8A mutation identified by wholegenome sequencing of a family quartet affected by infantile epileptic encephalopathy and SUDEP.Am. J. Hum. Genet.90, 502–510. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2012.01.006.

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