Mol Cell | 突破PRO-seq局限：rPRO-seq助力转录组高精度快速解析

摘要：测序技术是理解基因调控的基础工具。传统的RNA-seq技术虽然广泛应用，但它只能测量稳态RNA的丰度，主要反映成熟、稳定、存在于胞质中的RNA，而对许多重要但不稳定或低丰度的转录本（如增强子RNA（eRNA）、长链非编码RNA（lincRNA））几乎无法检测【

撰文 | 啾啾椰

测序技术是理解基因调控的基础工具。传统的RNA-seq技术虽然广泛应用，但它只能测量稳态RNA的丰度，主要反映成熟、稳定、存在于胞质中的RNA，而对许多重要但不稳定或低丰度的转录本（如增强子RNA（eRNA）、长链非编码RNA（lincRNA））几乎无法检测【1】。为此，研究者们发展了NRO-seq（nuclear run-on sequencing）类技术，如GRO-seq（global run-on sequencing）和PRO-seq（precision run-on sequencing）【2】。这些技术能够标记细胞中活跃的RNA聚合酶II（RNAPII），并以单碱基分辨率记录其位置，从而捕捉真实发生中的转录事件，揭示转录起始、暂停、延伸、终止等关键过程。

然而，PRO-seq等现有NRO-seq方法存在显著局限性。传统的PRO-seq实验要求至少1000万至2000万个细胞，步骤繁琐，包含多轮有机提取和凝胶分离，往往需要4到5天才能完成。在低起始量样本中建库效率极低，且容易生成接头二聚体（adapter dimer），严重影响数据质量【3】。因此，该方法难以应用于干细胞、神经元或临床样本等稀有材料中。虽然PRO-seq在分辨率和灵敏度上具有优势，但其高门槛和技术负担限制了广泛推广。

近日，迈阿密大学米勒医学院的Ramin Shiekhattar团队在Molecular Cell上发表了题为Enhancing transcriptome mapping with rapid PRO-seq profiling of nascent RNA的研究论文，提出并验证了一种全新的nascent RNA测序技术rPRO-seq（rapid PRO-seq）。该方法极大地简化了实验流程，提升了建库效率，尤其适用于起始细胞数量有限的样本，标志着转录动力学研究在技术层面取得了重要突破。

rPRO-seq在方法上引入了多项关键创新。首先，使用了预腺苷化的3 ’ 端DNA接头（App-DNA）进行连接，避免了ATP依赖性的非特异副产物，如RNA环化或多聚化。其次，在5 ’ 接头连接前加入了接头二聚体阻断寡核苷酸（DBO），可与游离3 ’ 接头配对，阻止其与5 ’ 接头形成二聚体。第三，整个建库过程使用磁珠和柱式纯化，取代了传统有机溶剂提取，显著降低RNA降解和样本损耗风险。得益于这些优化，rPRO-seq的整个流程可在12小时内完成，相比传统PRO-seq的4-5天大幅提速，且所需细胞数可低至5000个。

研究团队首先在HeLa细胞中对rPRO-seq与传统PRO-seq进行对比实验。使用10M细胞的传统PRO-seq结果作为参照，他们分别使用rPRO-seq在50万、10万、5万、2.5万个HeLa细胞上进行测序，发现即便在仅有2.5万个细胞的情况下，rPRO-seq也可获得与传统方法质量相当的转录图谱。无论是在转录起始区域、基因体区域，还是增强子区域，信号强度和分布高度一致，表明rPRO-seq在定量转录动力学上具有高度准确性和可重复性。

进一步，作者测试了rPRO-seq在仅5000个细胞中的表现。在HeLa细胞中构建INTS11的急性降解系统（dTAG），发现即使在极低起始细胞数下，rPRO-seq仍可敏锐检测到转录动态变化。特别是在INTS11被降解后，观察到RNAPII在启动子区域富集、基因体信号下降的现象，说明转录延伸受到抑制。这些结果说明，rPRO-seq具备在低样本量条件下进行机制研究的能力。

随后，研究者将rPRO-seq应用于生物医学相关模型，包括小鼠造血祖细胞（mHPC）和分化神经元，探索调控因子INTS11在不同背景下的功能。在mHPC中敲除INTS11后，发现有3525个基因表达显著改变，受影响的通路包括mRNA加工、IL-6信号、EGFR和胰岛素通路。RNAPII在启动子处停滞、基因体区信号减少，说明存在转录延伸障碍。同时，增强子区域的eRNA信号延伸，提示INTS11还参与转录终止。此外，在小鼠干细胞分化为神经元后急性降解INTS11，rPRO-seq揭示了长基因的转录延伸尤为受损。下调基因多为与神经发育和精神疾病相关的关键基因，进一步验证了INTS11在神经系统中的调控作用。

图1： rPRO-seq方法的建库流程与关键优势：在仅需5000个细胞的条件下，通过App-DNA和DBO提高连接效率、避免接头二聚体生成，实现对新生RNA的快速（12小时内）高精度测序。

综上所述，rPRO-seq是一项具有高度灵敏性、快速性和低样本量需求的新型转录组测序技术。它结合了快速建库（12小时）、低起始细胞（5000个）、高分辨率（单碱基）、适用于稀有或临床样本等优势，不仅大幅降低实验门槛，还拓展了nascent RNA研究的应用范围。rPRO-seq能够准确捕捉eRNA、lincRNA等低丰度新生转录本，并可广泛应用于发育、疾病、干细胞等领域的机制研究。相比传统PRO-seq，这项新方法具有更强的替代性和可扩展性，未来在基础研究和转化医学中具有广阔前景。

https://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(25)00579-9

制版人：十一

参考文献

1 . Gardini, A., and Shiekhattar, R. (2015). The many faces of long noncoding RNAs.FEBS Journal282, 1647–1657. https://doi.org/10.1111/febs.13101.

2. Churchman, L.S., and Weissman, J.S. (2011). Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.Nature469, 368–373. https://doi.org/10.1038/nature09652.

3. Mahat, D.B., Kwak, H., Booth, G.T., Jonkers, I.H., Danko, C.G., Patel, R.K., Waters, C.T., Munson, K., Core, L.J., and Lis, J.T. (2016). Base-pair-resolution genome-wide mapping of active RNA polymerases using precision nuclear run-on (PRO-seq).Nat. Protoc.11, 1455–1476. https://doi.org/10 .1038/nprot.2016.086.

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