摘要：作为一种天然倍半萜类化合物，α-红没药烯因其独特的香气、显著的抗氧化性，在医药和化妆品领域有着广阔的应用前景。然而在 α-红没药烯的生产过程中，传统的植物提取法原料有限、提取效率低下，提取工艺也复杂，大大增加了生产成本。

作为一种天然倍半萜类化合物，α-红没药烯因其独特的香气、显著的抗氧化性，在医药和化妆品领域有着广阔的应用前景。然而在 α-红没药烯的生产过程中，传统的植物提取法原料有限、提取效率低下，提取工艺也复杂，大大增加了生产成本。

在这种背景下，微生物发酵技成为生产 α-红没药烯的理想选择。其中，酿酒酵母不仅具备内源的甲羟戊酸（MVA）代谢途径，其能够利用葡萄糖独立合成 α-红没药烯的关键前体物质法尼基焦磷酸（FPP），而且酿酒酵母的遗传操作相对简便，发酵过程易于控制，为大规模生产 α-红没药烯提供了可能。

图|代谢工程改造的酿酒酵母菌株生产 α-红没药烯的过程

不过，在实际应用过程中，酿酒酵母生产 α-红没药烯仍面临着一个难题，即难以精准把握细胞生长与产物合成之间的平衡——过早激活产物合成途径会抑制酵母菌生长，而延迟启动则会降低其生产效率。此外，代谢负担也会限制细胞的生长，进而影响 α-红没药烯的产量。

为了解决这一问题，北京化工大学王萌教授团队近日于 ACS Synthetic Biology 发表了一篇题为“Developing Thermosensitive Metabolic Regulation Strategies in the Fermentation Process of Saccharomyces cerevisiae to Enhance α-Bisabolene Production”的研究，研究团队利用强化前体供应、温度敏感调控、发酵培养基优化等多项策略，成功构建了高产 α-红没药烯的酿酒酵母，最终，在补料分批发酵中的产量高达 18.6g/L，这是迄今为止报道的最高产量，为工业规模萜烯生物合成带来了新的途径。

为了增强 α-红没药烯生产的前体 FPP 的供应途径，研究人员过表达了 MVA 途径中从乙酰辅酶 A 到 FPP 的相关内源基因，包括 ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVDI、IDI 和 ERG20 等，构建了一系列工程菌株。结果表明，随着整合基因数量的增加，FPP 的产量也显著提高。最终，经过全面代谢途径增强的菌株 BFSC0001 在 FPP 产量上达到了 264.8 ng/mL，是起始菌株 5DΔ 的 44.9 倍。其在摇瓶中 96 h 后 α-红没药烯的滴度达 139.9 mg/L。

不过，仅增强 FPP 的供应并不足以实现 α-红没药烯的高效生产。研究人员进一步发现，α-红没药烯合成酶（Ag1）的活性有限，无法将所有 FPP 转化为 α-红没药烯，导致 FPP 的积累。

他们引入了温度敏感型的 GAL4M9 来替代 GAL 调控 Ag1 的表达，从而实现温度依赖的基因表达。在较高温度（如 30℃）下，细胞能够充分生长并积累足够的生物量；而在较低温度（如 26℃）下，目标基因的表达被激活，从而促进 α-红没药烯的合成。这种两阶段发酵策略不仅减少了中间代谢产物对细胞生长的负面影响，还显著降低了代谢负担，实现了生物量和产物积累的双重提升。

图| 通过调控 GAL 启动子，实现在 30℃ 促进细胞生长、26℃ 激活基因转录

为了提高 α-红没药烯的产量，团队对启动子进行了优化，最终确定了 pCYC1 启动子在 30℃/26℃ 两阶段发酵条件下表现最佳，使 α-红没药烯的产量达到了 216 mg/L，相比单一30℃ 发酵的起始菌株提高了 56.5%。

此外，为了进一步优化α-红没药烯的发酵生产，研究人员还借助了代谢组学分析。他们通过在发酵培养基中添加不同浓度的氨基酸，发现添加外源精氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丝氨酸和天冬氨酸等氨基酸能够显著促进细菌生长，并提高 α-红没药烯的产量。特别是当添加 100 mg/L 的 D-泛酸钙时，α-红没药烯的产量增加了 55.6%。这是因为 D-泛酸钙作为辅酶 A 的前体，对 α-红没药烯合成的关键前体物质乙酰辅酶 A 的合成起到了关键作用。通过响应面模型分析，研究人员还确定了最佳发酵培养基的组成，包括 20 g/L 的葡萄糖、15 g/L 的硫酸铵和 6.25 g/L 的七水硫酸镁。在这些优化条件下，α-红没药烯的产量在摇瓶发酵中达到了 658 mg/L，比未优化的基本发酵培养基提高了 98.3%。

图|研究人员探究不同发酵培养条件对 α-红没药烯产量影响

为了验证构建的 α-红没药烯酿酒酵母平台菌株在实际工业化生产的应用效果，研究人员在 2.5 L 和 30 L 的生物反应器中进行了补料分批发酵实验。通过精确控制发酵过程中的 pH 值、搅拌速度等参数，最终在 2.5 L 生物反应器中实现了 18.6 g/L 的 α-红没药烯产量，这是迄今为止报道的最高产量。在 30 L 生物反应器中，尽管产量略有下降，但仍然达到了 17.5 g/L。这些结果表明，通过温度敏感型调控策略、代谢通量优化和发酵条件的精细调整，利用酵母菌发酵高效生产 α-红没药烯并实现大规模工业化有着良好的前景。

参考文献：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.4c00728

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来源：生辉SciPhi