摘要：RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是一种转录后基因沉默现象，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物 mRNA 存在同源互补序列的双链 RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）在细胞内特异降解该 mRNA，从而使相应基因

作者：张建珍; 李帅; 李涛; 王艳丽

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是一种转录后基因沉默现象，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物 mRNA 存在同源互补序列的双链 RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）在细胞内特异降解该 mRNA，从而使相应基因沉默，抑制靶标基因的表达。RNA 农药是用来防治病虫害的双链核糖核酸（dsRNA），RNA 农药由于靶标特异性强、作用机制明确、无残留等特点和优势而逐步兴起，发展潜力巨大，是新兴的颠覆性前沿技术和植保领域重要的发展方向，已被列入《″十四五″全国农药产业发展规划》优先发展领域。目前，RNA农药在农业有害生物防治方面的应用方式主要包括以转基因作物为主的转基因植物 RNA 农药和直接喷施 dsRNA 为主的可喷洒 RNA 农药两种类型（图1）。相较于具有潜在风险的转基因植物 RNA 农药，外源施用的可喷洒 RNA 农药更符合公众对农药的认知，更具应用前景和市场潜力，是未来 RNA 农药的理想应用方式。作为新一代农药产品，RNA 生物农药在技术、环境等层面仍有诸多有待解决的问题，由于化学合成dsRNA 成本高，因此，低成本生产 dsRNA 已成为限制 RNA 农药大规模商业化亟待解决的问题。

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图1 RNAi在植物虫害防控领域的应用策略示意图

1、RNA 农药的生物合成

dsRNA 规模化生产的高成本是 RNA 农药商业化亟待解决的问题。已有研究表明，每公顷田地大约需要 2~10g dsRNA 用于作物保护。近些 年来，随着合成生物学的快速发展，其在提高农业生产力、降低生产成本以及实现可持续发展等方面的潜力日益凸显。通过改造和优化微生物菌种的基因片段，利用细菌、酵母、噬菌体和昆虫共生菌等微生物作为底盘生物，使得大量表达 dsRNA 成为可能。例如，美国 GreenLight Biosciences 公司开发了无细胞合成 dsRNA 的 GreenWorXTM 技术，可将 dsRNA生产成本降至 1 美元/g 以下（https：//www.greenlightbiosciences.com/）。加拿大 Renaissance BioScience 已获得酵母生产和递送 dsRNA 的专利，有望降低 dsRNA 施用成本（https: //renaissance bioscience.com/）。

1.1 细菌底盘生产 dsRNA 技术现状

大肠杆菌因其转化效率高、繁殖速度快及稳定成熟的操作体系，成为目前应用最为广泛的生产菌种。最早 Fire 等发现，大肠杆菌利用含有双向 T7启动子载体表达目标 dsRNA，可引起秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）幼虫产生特定干扰表型。我国早在 2010 年，有研究者通过微生物发酵技术，获得马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）脯氨酸脱氢酶基因双链 RNA，后续，更多学者将细菌表达 dsRNA 应用于对多种昆虫基因功能的相 关研究工作中。

迄今为止，大多数研究所使用的方法仍是采用RNaseIII 缺陷型大肠杆菌 HT115（DE3），在诱导型T7 启动子控制下产生 dsRNA（图2）。之后，有学者对细菌表达 dsRNA 的产量进行了探索。 2009 年Yin等使用三种不同菌株（JM109、HMS174、HT115）表达 dsRNA，发现 JM109 的 RNaseⅢ缺陷菌株产生的 dsRNA 是 HT115菌株的 2倍，表明 dsRNA 产量受到宿主菌株的影响。同时，还发现相同宿主菌株条件 下，使用单向 T7 启动子（pGEM-T Easy）所产生的dsRNA 较双向 T7 启动子（L4440）产量高，Ma 等的研究也证实了这个结果。研究表明，价格低廉的乳糖可以替代部分异丙基- β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG），诱导 dsRNA 的产生，且发现当乳糖和 IPTG 配比恰当时，可以将 dsRNA 的产量提高 5 倍左右。进一步研究表明，组成型启动子表达系统可以在不添加任何诱导剂时生产 dsRNA。随着对 dsRNA 产量的 关注和研究，发现通过优化发酵条件也可以大幅提 高 dsRNA 产量，如在 10 L 发酵罐中，分别使用补料发酵和分批发酵生产 dsRNA，结果表明，补料发酵dsRNA 获得量是分批发酵的近 30倍。对表达目标dsRNA 片段序列进行分析，发现当鸟嘌呤（Guanine，G）和胞嘧啶（Cytosine，C）含量为 30%、50% 和 70%时，dsRNA 的产量分别为 22. 47 mg/L、10. 08 mg/L和 7. 48 mg/L，表明 GC含量越高，其 dsRNA表达产量越低。综上所述，以细菌为底盘生物生产 dsRNA其产量受诸多因素影响。

图2 细菌为底盘的 dsRNA 生产技术示意图

2.2 酵母底盘生产 dsRNA 技术现状

酵母以遗传信息清晰、基因组编辑工具丰富、安全性高、环境友好等优势常被用作工程菌。酵母中缺乏 Dicer 系统，可表达积累大量 dsRNA（图3）。这些特性加速了基于酵母 RNA 高效表达及安全有效递送平台的研发。例如，应用酵母内源 GPD 组成型启动子，驱动埃及伊蚊（Aedes aegypti）和按蚊（Anopheles gambiae）基因组中 siRNA 靶向序列相对应的 shRNA，将 shRNA 表达单元组装至非整合的 pRS426 GPD 酵母穿梭质粒并转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），制备酵母制剂饲喂幼虫，实现了 90% 以上的沉默效率和 100% 幼虫致死率。Murphy 等首次应用酿酒酵母表达果蝇 yTubulin基因 dsRNA，可将 dsRNA 的相对表达量提 升至对照组的 800 倍左右，将重组酵母饲喂果蝇后1~4 天，成功抑制了靶基因的表达。加拿大 Renaissance BioScience公司建立了以酿酒酵母发酵生产dsRNA的技术平台，通过在酵母中表达针对不同物种靶标基因的 dsRNA，用于害虫防控。2021 年 9 月，该公司宣布，研发成功基于喷洒的针对马铃薯甲虫的 RNA 生物农药产品，在一项独立测试中对幼虫的致死率达到 98. 3%，大大降低了马铃薯甲虫对作物造成的损害（https：//renaissancebioscience.com/）。

图3 酵母为底盘的 dsRNA 生产技术示意图

2.3 无细胞生产 dsRNA 技术现状

无细胞系统（cell-free system，CFS）已逐渐成为合成生物学强有力的生产工具之一。1961 年，Nirenberg 和 Matthaei首次建立了大肠杆菌无细胞蛋白合成系统并成功破译出编码蛋白质的三种密码子。能量再生对于 CFS 至关重要，为了解决 CFS 转录 RNA 和合成蛋白时的能量供应问题，Yang 等使用核苷单磷酸盐替代高能磷酸以降低反应成本，Swartz 等则通过添加 β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和辅酶 A，使其可从任何糖酵解中间途径实现 ATP 的有效再生。由于无细胞系统可针对特定目的开发定制解决方案，具有提取物制备简单、经济、容易采样、方便监测、便于高通量筛选等诸多优点，因此，无细胞系统表达蛋白具有显著优势，但目前无细胞系统表达 dsRNA 鲜有报道。GreenLight Biosciences 公司在网页的产品介绍中提到，已开发成功无细胞系统技术，有望低成本大规模生产dsRNA，实现田间喷施，从而解决防治马铃薯甲虫RNA 农药的成本问题（https：//greenlightbiosciences.com/category/products/），但尚未见公开的文献报道。图4 为无细胞系统 dsRNA 生产体系示意图。

图4 无细胞系统 dsRNA 生产技术示意图

无论是以原核细胞细菌、真核细胞酵母为底盘生物合成 dsRNA 还是利用无细胞体系进行 dsRNA的合成，三种方法均依赖于转录过程合成 dsRNA。以原核细胞细菌合成 dsRNA，其产量高、成本低、易 于操作，但在生产过程中细菌合成的 dsRNA 需要经过裂解、提取和纯化等步骤，过程相对繁琐；以真核细胞酵母合成 dsRNA 体系，安全性高，且由于酵母缺乏 Dicer 系统，有利于 dsRNA 的积累，但因产量较 低，成本相对较高；不依赖于细胞体系的无细胞合成dsRNA 可以产生高纯度的 dsRNA，但需要专业的设备和技术支持，操作相对复杂。总的来说，细菌合成 dsRNA 成本低适合大规模生产，但需要考虑纯化和生物安全性问题；酵母合成 dsRNA 安全性较高，适合对生物安全性要求较高的应用，但产量较低；无细胞合成 dsRNA 适合高纯度需求，但需要较高的技术支持和设备投入。

2、RNA 农药产业化现状与前景

2023 年 3 月，《2022 年中国合成生物学绿色应用与产业感知调研报告》评选出了国内合成生物学″十大典型应用″，以合成生物技术制备 RNA 纳米农药成功入选。2024 年 12 月，RNA 杀虫剂的田间应用被列为 2024 年度十大科学突破之一。随着国际上首款 RNA 生物农药获得美国环保署（EPA）登记批准，消费者对绿色、安全农产品的需求不断增加，推动了农业生产向绿色、可持续方向发展。RNA 农药作为新型绿色农药，能够满足市场对农产品质量安全和环境保护的要求，市场需求有望持续增长。据辰宇信息咨询报告，2023 年全球 RNA 生物农药市场规模约为 1.16 亿美元，预计 2030 年 达到2.09亿美元，2024—2030年期间年复合增长率（Compound Annual Growth Rate，CAGR）为 8.8%（https：//winmarketresearch.com.cn/home/goods/detail/id/1800128.html）。

截止目前，我国已针对 RNA 生物农药产业化出台多项发展规划，《″十四五″全国农药产业发展规划》将 RNA 杀虫剂等 RNA 农药列入优先发展领域，为 RNA 农药的研发、生产和应用提供了政策导向，推动行业加大在该领域的投入。2024年 11月 5日，农业农村部发布《农业农村部关于修改〈农药登记管理办法〉等 5 部规章（征求意见稿）》，该规章虽不是专门针对 RNA 农药，但制定了农药管理的基础规范，RNA 农药的登记、生产、经营等环节也将依据该规章进行管理，为 RNA 农药的规范化发展提供了基本的制度框架。2024 年 4 月 8 日，农业农村部农药管理司农药登记信息（2024 年第 5 期）指出，新农药应当具有创新性，与已登记产品相比，在安全性和有效性等方面应当具 有明显优势。申请登记 RNA 农药，也需遵循这一原则，确保其在市场上具有独特的价值和竞争力。

目前，应用 RNAi 技术实现病虫害防治主要是通过转基因作物和喷施法实现 RNAi。在转基因作物方面，国外的拜耳、杜邦、陶农科和先正达等传统农药公司均集中于研究 RNAi 在杀虫、杀菌、抗病毒和抗线虫等方面的应用。拜耳公司（孟山都）2017 年推出了第一款表达玉米 根萤叶甲（Diabrotica virgifera virgifera）dsRNA 的玉米种子 MON87411，商品名为 SmartStax®Pro。科迪华公司（陶氏、杜邦）培育出表达 dsRNA 的抗虫玉米品种 DP23211，并获得澳新食品标准局批准。辛普劳公司（J.R.Simplot）推出的马铃薯 E12 品种，其表达的 dsRNA 可抗黑斑病毒（Black Spot Virus）（https：//www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp？Even tID=381&Event=E12）（商品名为 Innate®Cultivate）。在我国，中国科学院上海植物生理生态研究所在模式植物中表达棉铃虫（Helicoverpa armigera）P450基因的 dsRNA，降低了棉铃虫对棉酚的抗性。中国科学院微生物研究所构建了利用 RNAi 抗黄萎病的棉花品种。中国农业科学院植物保护研究所培育了抗绿盲蝽（Apogus lucorum）的转基因玉米与大豆。

在通过喷施法实现 RNAi 方面，欧美多家新兴生物科技公司均纷纷投资喷施型 RNA 农药的研发，2019 年，拜耳公司在美国环境保护署登记了第一例dsRNA 农药 BioDirect，可用于喷施防治寄生蜜蜂的狄斯瓦螨（Varroa destructor）；GreenLight Biosciences 公司开发了喷雾型 dsRNA 杀虫剂，防治科罗拉多马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata），并于2023年 12月获得了美国环保署批准，成为世界上第一款允许商业使用的可喷施 RNA 生物农药（https：//www.epa.gov/pesticides/epa-registers-novel-pesticidetechnology-potato-crops）。

目前，我国已有数家科研团队开展 RNA 农药研发，由上海交通大学唐雪明教授创立的硅羿科技（上海）有限公司研发针对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的 RNA 农药，并于 2021 年通过全国农药标准化委员会审核，首次获得″核酸干扰素″的命名函（https：//www.guiyitech.cn/）。上海植生优谷生物技术有限公司致力于棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）和黄曲条跳甲（Phyllotreta striolata）等害虫的喷施型 RNA 农药研发。该公司已与浙江利民控股股份有限公司签署战略合作协议，宣布双方将基于各自的核心竞争力和业务优势，共同致力于发展以合成生物学技术、核酸干扰技术和递送系统为底层技术的 RNA 生物农药，共同创制研发、推广应用新型农用 RNA 生物农药产品。由山西大学张建珍教授团队联合侨昌现代农业有限公司共同成立的北京微沃生物科技有限公司，针对飞蝗、玉米螟、蚜虫和线虫等重大农业害虫，在防治新靶标创制、RNA 农药的生物合成及天然纳米材料递送等新技术领域取得突破性进展，有望解决农业植保领域存在的害虫有效防控、农业环境保护和食品安全等问题。

我国在利用 RNAi 技术进行病虫害防治领域的基础研究起步较早、起点较高，但由于缺乏规模化、系统化的研究投入，目前，在应用领域、与国际农化巨头还存在一定的差距。在此背景下，迫切需要我们加快在该领域的研究步伐，建立与RNA生物农药相匹配的研发、应用和生产等技术标准，完善相应的法律法规，对生产进行指导与监管，以此促进RNA生物农药的商业化进程（http：//

总结与展望

当前，我国尚无商品化的 RNA 农药产品，RNA生物农药的登记还处于起步阶段，实现 RNA 农药的产业化应用，仍存在一些问题急需解决。首先，在农药产品登记方面，国家农业农村部目前尚无相关产品标准，因此，需要管理部门、农药企业和高校科研院所共同联合，积极推动相关标准的制定。其次，RNA 农药的生物合成要优化发酵和分离纯化等工艺，实现规模化、低成本生产，以满足产业化和市场化需求。最后，RNA 农药的安全性评估是产业化应用的必要环节，需要开展相关研究工作，以确保非靶标生物和生态环境的安全。

来源：世界农化网