摘要：今天，我们从scWestern的发展历史、技术原理到实战案例，全面解析这项颠覆性技术，并揭示国产设备如何助力科研“卷”出新高度！
传统Western Blot需要上百万个细胞？单细胞蛋白检测只能依赖质谱？
水熊健康科技单细胞蛋白免疫印迹（scWestern），仅需一个细胞即可完成蛋白定量分析！
今天，我们从scWestern的发展历史、技术原理到实战案例，全面解析这项颠覆性技术，并揭示国产设备如何助力科研“卷”出新高度！
一、Western Blot进化史：
从定性工具到单细胞定量革命
1979年奠基
Towbin团队在《PNAS》发表经典Western Blot技术，确立蛋白转膜流程（Towbin H, et al. PNAS, 1979），但依赖放射性标记、操作繁复。
2010自动化革新
预制胶与干转技术：Bio-Red、Invitrogen推出快速转膜方案，耗时从小时级缩至分钟级。
全自动毛细管电泳：ProteinSimple的Wes系统采用毛细管电泳+化学发光实现“上样-检测”全流程自动化，3小时完成高精度定量。
2014单细胞Western Blot问世
Hughes A J等在《Nature Methods》上发表文献，首次提出"Single-cell Western blotting"（Hughes A J, et al. Nature Methods, 2014）。在载玻片表面加工20μm微孔捕获单细胞，微孔内完成细胞裂解→蛋白电泳→紫外光交联固定（免转膜），抗体杂交检测低至0.3 amol（≈18,000个分子）的β-肌动蛋白。
与单细胞 RNA 测序的发展类似，单细胞蛋白免疫印迹 (scWestern) 可以提供蛋白质表达的异质性信息。
2022水熊科技scWestern：
中国智造新里程碑
水熊科技推出scWestern检测设备及配套试剂盒，采用自主知识产权的光敏凝胶+微阵列芯片，可灵活定制的芯片孔径，精准适配不同细胞尺寸，为中国智造注入强劲动力。
从Western Blot到scWestern的进化历程概括为：
群体蛋白定性 → 自动化定量 → 单细胞分辨率 → 国产智造
二、单细胞蛋白免疫印迹：
如何把Western Blot“缩小”到单个细胞？
技术的创新是一个不断迭代的过程，Western Blot也不例外，首先是要发现问题：
传统Western Blot面临的挑战
样本需求大：需提取10^5~10^6个细胞，无法解析细胞异质性
灵敏度不足：低丰度蛋白易被噪音淹没
通量低：一次实验仅能检测1种蛋白
有需求，就会有创新，针对传统Western Blot的不足
scWestern提出解决方案
1. 把样本需求量降到单个细胞水平
微阵列芯片：单细胞的“精准牢笼”
采用光刻纳米加工技术，在光敏凝胶中加工微阵列孔，精准捕获不同大小的细胞类型，实现单细胞分离
2. 把蛋白损失将至最低
光敏凝胶：替代PAGE胶和PVDF膜的“极速凝胶”
6min完成细胞裂解-蛋白电泳-蛋白固定，凝胶内原位捕获蛋白，无需转膜, 一张光敏凝胶芯片实现蛋白分离、固定和抗体孵育的功能，避免蛋白逸散与信号损失，精准定量蛋白表达。
3. 荧光二抗替代HRP二抗
多重检测：荧光抗体定量“蛋白表达”
采用荧光抗体杂交，定量蛋白表达，一张芯片同步分析10+靶标；
图1：scWestern工作流程（微阵列芯片捕获单细胞→电泳分离→蛋白固定→凝胶原位抗体杂交→信号成像, Precision Oncology, 2018）
单细胞免疫印迹如何推动肿瘤研究？
案例1：破解BRCA1突变致癌机制
问题：BRCA1突变携带者乳腺癌风险激增，但癌变前驱动机制不明
方案：
单细胞RNA测序发现突变携带者luminal1型上皮细胞中KRT23基因异常高表达
scWestern验证：在突变携带者单个luminal1型上皮细胞中，KRT23蛋白表达量较对照组提升近3倍（图2)
价值：首次在蛋白层面证实BRCA1突变导致上皮分化紊乱(Nature Genetics, 2023）
图2：scWestern验证KRT23蛋白在单细胞水平异常表达。
案例2：HER2阳性乳腺癌耐药元凶——t-erbB2同工型
挑战：传统IHC无法区分HER2全长蛋白（p185）与截短耐药型（t-erbB2）
突破：
scWestern通过分子量差异（185kDa vs. 90-115kDa），在单细胞中同步检测两种亚型
发现耐药患者肿瘤内t-erbB2阳性细胞占比高达40%（图3)
意义：为HER2靶向治疗分层提供全新维度(Precision Oncology, 2018）
图3：scWestern区分HER2与t-erbB2（左：scWestern结果；右：临床样本验证）。
单细胞免疫印迹如何解密干细胞命运调控？
案例1：追踪心肌细胞分化轨迹
问题：hiPSC分化的心肌细胞（hiPSC-CMs）存在显著异质性，传统方法无法量化亚群蛋白动态
方案：
scWestern同步检测：在单细胞水平分析MLC2V（心室标志）与MLC2A（心房标志）共表达
清除抗体干扰：通过分子量差异精准排除非特异性结合信号（图4)
价值：首次捕获hiPSC-CMs从MLC2A+单阳性→MLC2A+/MLC2V+双阳性的分化路径(J Mol Cell Cardiol, 2020）
图4: scWestern 检测MLC2V（MYL2）和MLC2A（MYL7）蛋白表达。 A.荧光信号区分MYL2+，MYL7+， MYL7+MYL2+双阳性细胞亚群。B.条带大小区分抗体非特异性结合（图中条带3为MCL2A抗体非特异性结合信号）。
案例2：解码肠道干细胞代谢开关
问题：酮体代谢如何调控肠道干细胞（Lgr5+ ISC）自我更新？
方案：
scWestern靶向验证：在流式分选后的单个Lgr5+ ISC中检测酮体合成酶HMGCS2
定量亚群占比：发现77.97% Lgr5+ ISC高表达HMGCS2（vs. 隐窝细胞21.17%）(图5)
价值：揭示β-羟基丁酸通过抑制HDAC增强NOTCH信号，驱动干细胞适应性（Cell，2019）
图5：scWestern检测Lgr5+ ISC肠道干细胞中77.97%表达HMGCS2；总肠隐窝细胞群中观察到21.17%表达HMGCS2。
单细胞免疫印迹如何重塑免疫学认知？
案例1：破解B细胞白血病克隆竞争
问题：STAT5与ERK通路激活是否共存于同一白血病细胞？
方案：
scWestern磷酸化检测：对6例B-ALL患者单细胞分析STAT5-pY694/ERK-pT202-Y204（图6，图7)
价值：证实STAT5/ERK激活属于竞争性克隆（非共存），为靶向联合治疗提供依据(Nature, 2020）
图6: scWestern芯片。检测Histon H3在单个细胞中的表达，每个亮点代表一个细胞中Histone H3蛋白的荧光信号
图7:单个细胞在scWestern芯片泳道内裂解并电泳。使用STAT5-pY694 和 ERK-pT202/Y204磷酸化蛋白一抗进行免疫杂交，二抗偶联荧光素，检测荧光信号反应磷酸化蛋白表达强弱。
案例2：纠正炎症小体认知误区
问题：GM-CSF诱导的BMDC模型中，究竟何种细胞分泌IL-1β？
方案：
scWestern多重检测：同步分析单细胞中ASC/IL-1β/Tubulin表达
精准分群验证：对比GM-Macs（P7/P8）与GM-DCs（P6）的LPS响应差异（图8）
价值：颠覆性证实巨噬细胞（非树突细胞）主导炎症小体激活，修正110余篇论文结论（Nat Immunol, 2019）
图8：scWestern检测GM-Macs和GM-DCs 细胞中ASC、IL-1β和Tubulin蛋白表达。
三、水熊科技 scWestern“中国方案”
核心优势
自主产权光敏凝胶：单芯片集成细胞裂解、蛋白电泳、原位固定及抗体杂交全流程，替代传统多步骤操作。
光刻纳米微阵列芯片：孔径灵活定制（常规30μm/60μm/100μm），精准适配不同细胞尺寸，捕获效率高达90%。
性能突破
⚡ 通量大：单次检测超6000个细胞，支持高通量研究
⚡ 时间短：6分钟完成裂解-电泳-固定，全流程仅需4-6小时
⚡ 靶标多：同步检测10+蛋白标志物，覆盖信号通路关键节点
⚡ 成本优：单次测试成本低至千元内，试剂消耗降幅超80%
应用方向
应用实例
1. 细胞异质性研究
单细胞Western Blot检测Hela细胞内参蛋白Gapdh与靶标蛋白PARP1表达量，测试同一样本不同孔间差异性。
图9：scWestern 检测Hela细胞内参蛋白 Gapdh。芯片扫描及局部放大图像（裂解时间20s；电泳时间45s）
图10： scWestern检测Hela细胞靶标蛋白PARP1。芯片扫描及局部放大图像（裂解时间20s；电泳时间45s）
图11: scWestern检测Hela细胞内参蛋白Gapdh与PARP1数据统计结果。显示内参蛋白Gapdh平均荧光强度变异系数CV=5.4%，统计细胞数=2806；靶标蛋白PARP1平均荧光强度变异系数CV=10.2%，统计细胞数=1609。
2. 共表达细胞亚群分析
单细胞Western Blot检测人胃腺癌细胞AGS细胞系EAD、P85靶标共表达，Tubulin为内参蛋白。
图12: scWestern检测人胃腺癌细胞AGS细胞系EAD、P85靶标共表达。EAD阳性细胞亚群占比50%，P85阳性细胞亚群12.1%，两个靶标呈现明显的上下游关系。
应用场景
肿瘤免疫微环境解析：单细胞水平解析PD-1/CTLA-4等免疫检查点共表达
多组学数据验证：scRNA-seq差异基因的蛋白表达验证
基因编辑效率评估：单细胞水平同步检测编辑蛋白与功能标记物
稀有细胞研究：循环肿瘤细胞、干细胞亚群中低丰度信号蛋白检测
scRNA-seq差异基因的蛋白表达验证
水熊健康科技（南通）有限公司持续围绕单细胞和微量样本时空蛋白组检测布局系列产品，包括单细胞多重蛋白分析系统、全蛋白组富集试剂盒、蛋白翻译后修饰富集试剂盒、TSA多重免疫荧光试剂盒、膜特异性外泌体富集试剂盒等，为多组学相关研究与产业化提供完整解决方案。
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参考文献
1. Towbin H, et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS, 1979, 76(9):4350-4.
2. Hughes A J, et al. Single-cell western blotting. Nature Methods, 2014, 11(7): 749-755.
3. Nee K, et al. Preneoplastic stromal cells promote BRCA1-mediated breast tumorigenesis. Nature Genetics, 2023, 55(4):595-606.
4. Kang C C, et al. Electrophoretic cytopathology resolves ERBB2 forms with single-cell resolution. Precision Oncology, 2018, 22:2:10.
5. Jabart E, et al. Single-Cell Protein Expression of hiPSC-derived Cardiomyocytes using Single-Cell Westerns. J Mol Cell Cardiol, 2020, 149:115-122.
6. Cheng C W, et al. Ketone body signaling mediates intestinal stem cell homeostasis and adaptation to diet. Cell, 2019, 178(5):1115-1131.
7. Chan L N, et al. Signaling input from divergent pathways subverts B-cell transformation. Nature, 2020, 583(7818):845-851.
Erlich Z, et al. Macrophages, rather than DCs, are responsible for inflammasome activity in the GM-CSF BMDC model. Nature Immunology, 2019, 20(4):397-406.
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来源：小桔灯网