光遗传高密度微电极联用解析单细胞活动与神经网络同步的动态互作

摘要：神经元网络的同步活动对大脑功能至关重要，但单神经元活动如何受网络全局状态（如爆发）调控，以及单神经元如何引发网络级活动，目前仍不明确。例如，癫痫发作时网络过度同步为何导致认知障碍，是否与单神经元响应特性改变有关？

HD-MEA结合光遗传学

神经元网络的同步活动对大脑功能至关重要，但单神经元活动如何受网络全局状态（如爆发）调控，以及单神经元如何引发网络级活动，目前仍不明确。例如，癫痫发作时网络过度同步为何导致认知障碍，是否与单神经元响应特性改变有关？

本期文献解读，我们选取了在Nature Communications（IF2023=14.7）发表的题名为“Revealing single-neuron and network activity interaction by combining highdensity microelectrode array and optogenetics”的文章，本研究利用高密度微电极阵列（HD-MEA）与光遗传学结合的技术，在大鼠皮层神经元体外培养网络中探索单神经元活动与网络同步活动的交互机制。

研究亮点

1. 跨尺度实验平台的建立

整合HD-MEA（26400个电极，17.5 μm 间距）与光遗传学，首次实现单细胞分辨率的双向操控（刺激+记录）。该系统可同时追踪 321 个神经元，直接响应率 > 95%，为跨尺度研究提供了通用工具。

2. 网络爆发对单细胞功能的调控机制

研究发现“爆发依赖响应变化”（BDRC）现象 —— 网络爆发后单细胞响应潜伏期延长 > 1 ms，变异系数（CV）增加，且连续爆发可导致持续响应改变。这为解释癫痫发作时的信息丢失（如 TCI）提供了单细胞层面的证据，提示突触可塑性或离子通道状态改变是潜在机制。

3. 枢纽神经元的直接验证

通过光刺激筛选出 1.3% 的 “主导神经元”，其自发爆发可 100% 触发全网络活动，且具有固有爆发性放电模式（~100 Hz）。结合免疫染色定位，证实其结构与功能枢纽特性，为理解大脑中 “自下而上” 的网络启动机制提供了实验范例，也为神经调控治疗（如抑制癫痫起始灶）奠定了基础。

Maxwell HD-MEA

Maxwell HD-MEA的很多特点使得它受到计算神经科学家及人工智能科学家们的青睐：

⚫3265 electrods/mm2的高密度电极

Maxwell MEA芯片上（图6）有26400个电极。这样的密度使其可以记录2D培养物中几乎每一个活细胞；而对于3D类器官更为关键，因为类器官与芯片接触面积通常比较小，如此高的密度提供了足够的记录位点获取大量神经元信息。

⚫可放在培养箱内进行记录

这使得在记录过程中细胞能够维持良好的生理状态，支持反复长期的检测。

⚫低本底噪音，高信噪比

仅为2.4微伏的本底噪音保证了高质量的读取信号，使得AI系统获得足够丰富的输出信息。

⚫电极可作为刺激电极

在2万多个电极中每一个电极都可作为刺激电极给出刺激，这在构建的AI系统中成为重要的信息输入的媒介。在此，高电极密度也为这种信息输入提供了高空间分辨率的特性。

⚫可开放API，实现快速实时反馈系统

Maxwell HD-MEA可开放API，允许其它软件的操控，灵活地设计输入输出模式，能够在输入与输出间建立实时的反馈。

研究结果

结合电记录与光遗传学刺激

本研究构建了整合HD-MEA电记录与数字微镜器件（DMD）光遗传刺激的实验系统，实现单细胞精度的神经网络活动调控与监测。系统置于避光恒温（37°C）环境中，并维持CO₂浓度以保障神经元活性。实验采用大鼠皮层神经元，培养于含26,400微电极（间距17.5μm）的HD-MEA芯片，通过腺相关病毒转染光敏蛋白ChR2-GFP。经荧光显微镜验证表达后，选用体外成熟（＞30天）的神经网络进行实验。该平台兼具高时空分辨率的光刺激与电信号采集能力，为解析神经环路功能提供关键技术支撑。

图1：结合数字微镜器件刺激与高密度微电极阵列记录的实验系统

a 实验系统概览，包含电信号、光信号和TTL信号传输路径
b 湿润含CO₂空气供给系统
c 记录系统实物图
d 刺激位点选择流程。将GFP荧光图像网格化后人工选择刺激位点（红色方格）
e 光刺激程序。依次对各选定位置进行光刺激

光刺激诱导可靠的直接反应与突触反应

通过整合光遗传刺激与高密度微电极阵列（HD-MEA）记录，系统探究了单神经元分辨率的直接电响应与突触介导的间接响应特性。实验采用表达ChR2-GFP的大鼠皮层神经元培养体系，通过腺相关病毒转染实现光敏蛋白标记，并利用DMD进行空间精准光刺激（50×50 μm²光斑，5 ms脉冲，15.4 mW/mm²强度）。刺激伪迹通过带通滤波（300–3500 Hz）和限制刺激范围得以抑制，确保直接反应锋电位（延迟4.43±1.21 ms，抖动0.62±0.48 ms）的可靠检测。

研究发现，光刺激可稳定诱导目标单神经元放电（77.3%神经元响应率>95%），同时记录到突触传递的间接响应。间接响应神经元表现出显著延迟与抖动，归因于轴突传导（~200 μm/ms）、突触传递（~3 ms）及树突整合的时序差异。在66个刺激位点中，共检测到66个直接响应与125个间接响应神经元，证实光刺激可有效解析神经网络的单细胞级功能连接。

针对1 Hz刺激可能诱导长时程抑制（LTD）的担忧，实验显示响应概率始终维持高位（>0.95），延迟变化20%升高或降低），提示非线性整合机制。通过电活动与荧光成像的时空关联，研究直接观测到直接响应神经元激活后突触驱动的间接响应级联，并鉴定出4%的神经元可整合两种以上刺激输入。

该平台的优势在于无偏倚的全网络同步记录能力。例如，一个神经元对三种不同刺激均表现一致的间接响应，其电位波形与传播方向高度可重复，证实其为突触信息整合节点。

a 刺激后信号示例（上：原始信号；下：300-3500Hz带通滤波信号）。灰色：单次刺激信号；蓝色：刺激时间锁定平均信号
b 上：122个细胞在1Hz光刺激下的锋电位数量直方图（分箱宽度1秒）；下：1024个记录通道的栅格图（红色箭头标记刺激起始时间）
c 放大栅格图。绿、蓝、红竖线标记典型刺激时间点（各神经元刺激间隔1秒）

a 刺激时间锁定的空间电位分布（电极间距17.5μm）
b 箭头标记电极的信号：b-1直接响应；b-2间接响应
c 免疫荧光共聚焦图像（灰色：MAP2标记神经元胞体与树突；红色：NeuN标记胞体；绿色：GFP表达神经元；蓝色：DAPI标记细胞核）
d 刺激后细胞外电位热图

a 直接响应神经元的锋电位时间热图（黑色圆圈为刺激位置，背景为GFP荧光图像）
b 整合神经元（绿色圆圈标记）的响应热图
c 整合神经元的锋电位触发平均信号（右下示意图中黑色圆圈为刺激位点，绿色圆圈为整合神经元位置）

单神经元爆发放电依赖的响应变化

通过监测光刺激下神经元响应延迟的动态变化，揭示了网络爆发放电对单神经元活动的调控作用。实验发现，神经网络在周期性光刺激下会自发产生爆发放电（图5a红色标记），爆发结束后神经元的响应延迟先出现阶跃式改变，随后逐渐恢复（图5a-c）。间接响应神经元同样表现出显著的延迟波动（图5d）。量化分析显示，网络爆发会全局性增加响应延迟的变异系数（CV）（图5e）。通过定义爆发放电依赖响应变化（BDRC），发现73个神经元中36%的延迟延长超过1 ms（92.7%事件为延长），仅5.5%表现为缩短（图5f）。连续爆发（间隔诱发更强烈且持久的BDRC（图5g-h）。这些结果表明，神经元对光刺激的响应具有适应性，而网络爆发会破坏这种适应，尤其是连续爆发可导致单神经元活动模式的显著改变。

a 典型电极的响应延迟变化（红色竖线标记网络爆发时间）
b 图a局部放大
c 网络爆发前后刺激触发的细胞外电位波形（蓝色横条为5ms刺激时长）
d 连续爆发后响应延迟的持续改变示例
e 响应延迟变异系数（CV）的爆发依赖性变化
f 各神经元的爆发依赖性响应变化（BDRC）排序
g 单次与连续爆发的BDRC比较
h 单次与连续爆发的BDRC持续时间比较

主导神经元触发网络爆发活动

本研究揭示了神经网络中特定"主导神经元"在触发全网络爆发活动中的关键作用。通过在培养的大鼠皮层神经元网络中进行光遗传刺激和高密度微电极阵列记录，研究人员发现约1.3%的神经元（4/290）具有触发网络爆发的特殊能力，其中最强效的主导神经元触发概率高达98%。这些神经元不仅在光刺激下能可靠诱发网络爆发，在自发活动中同样表现出100%的触发效率，证实了单个神经元对全网络活动的强大控制力。

研究采用多模态方法系统表征了主导神经元的特性。电生理记录显示，刺激诱导和自发爆发的传播模式高度一致，表明主导神经元与网络建立了稳定的功能连接。免疫染色技术成功实现了对主导神经元的形态学鉴定。进一步分析发现，这类神经元表现出典型的双峰峰峰间隔（ISI）分布，以约100Hz的高频爆发性放电为特征，符合内在爆发型神经元的电生理特性，提示其特殊的离子通道组成可能是其枢纽功能的基础。

值得注意的是，网络爆发并非完全由单一主导神经元垄断。数据显示，33%的自发爆发由主导神经元触发，而67%源自其他位点，表明神经网络具有多中心的爆发启动机制。通过精确定位刺激实验，研究发现爆发触发具有空间特异性：虽然邻近区域（50μm范围内）的刺激有时也能诱发爆发，但不同位点诱发的爆发在传播模式和延迟时间上存在显著差异，提示局部微环路在爆发产生中的精细调控作用。

a 刺激期间的栅格图（蓝线标记主导神经元刺激时间）
b 主导神经元受刺激时的放电模式（时间0为刺激起始）
c 爆发传播模式相似性矩阵（诱导爆发与自发1类爆发模式相似）
d 诱导与自发爆发的传播模式（红色点表示主导神经元放电）
e 神经网络荧光图像（右图为白框区域放大，红圈标记主导神经元）
f 主导神经元峰峰间隔的双对数图（a、d图中红点对应主导神经元活动）

研究总结

此研究通过整合HD-MEA与光遗传学，建立跨尺度实验平台，首次实现单细胞分辨率的双向操控（刺激+记录），解析了网络爆发与单神经元活动的双向调控机制，证实了主导神经元的启动作用和网络状态对单神经元功能的动态调制，为脑科学和神经疾病研究提供了关键工具与理论依据。

参考文献：

Kobayashi T, Shimba K, Narumi T, et al. Revealing single-neuron and network-activity interaction by combining high-density microelectrode array and optogenetics. Nat Commun. 2024 Nov 11;15(1):9547. doi: 10.1038/s41467-024-53505-w.

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