摘要：季节性流感疫苗包含来自不同亚型的病毒株，这些病毒株独立生长，然后组合。然而，大多数人对这些菌株之一表现出更强烈的反应，因此容易受到其他菌株的感染。美国斯坦福大学Mark M. Davis等人发现宿主遗传学是流感病毒株亚型偏倚的驱动因素。此外，来自不同病毒株的异

季节性流感疫苗包含来自不同亚型的病毒株，这些病毒株独立生长，然后组合。然而，大多数人对这些菌株之一表现出更强烈的反应，因此容易受到其他菌株的感染。美国斯坦福大学Mark M. Davis等人发现宿主遗传学是流感病毒株亚型偏倚的驱动因素。此外，来自不同病毒株的异源血凝素（HA）的共价偶联可以在很大程度上消除动物模型和人扁桃体类器官系统中的亚型偏倚。因此，他们提出异源抗原的偶联通过扩大T细胞帮助来改善流感病毒株之间的抗体反应，并且发现使用这种方法显著改善了对禽流感HA的抗体反应。

文章介绍

题目：Coupling antigens from multiple subtypes of influenza can broaden antibody and T cell responses

杂志：Science

影响因子：44.7

发表日期：2024年12月

#1

研究背景

Background

流感病毒感染每年在全世界造成估计290,000至650,000人死亡和数百万人住院治疗。人类感染主要限于甲型流感（H1N1和H3N2亚型）和乙型流感（维多利亚[B(vi)]和山形谱系[B(ya)]）。每年都会使用预计最流行的每种类型的菌株配制季节性疫苗。流行毒株和疫苗毒株之间的错配可能是毁灭性的，但即使精确匹配，疫苗的效力也有限。在过去十年中，流感疫苗的总体有效性从19%上升到60%。因此，人们呼吁开发更有效的疫苗。

大部分接种疫苗的个体对疫苗制剂中的一种菌株产生更高的反应，必须了解导致这种反应的因素。Thomas Francis提出了一种对这种亚型偏倚的解释-“原始抗原罪”（OAS）。OAS是指优先诱导对先前暴露产生的引发免疫原具有更高亲和力的抗体，而不是季节性疫苗制剂中存在的加强免疫原。其他研究表明，在暴露于漂移抗原后，记忆B细胞的顺序募集能够产生交叉反应性抗体，并增强对季节性疫苗接种的反应。然而，这种抗体通常较为罕见，且仅占季节性疫苗反应的有限部分，需要每年更换制剂。虽然OAS可能影响部分反应，但其对人类对漂移免疫原反应的影响程度尚不清楚。

由多基因和高度多态性人类白细胞抗原（HLA）基因座编码的细胞表面主要组织相容性复合体（MHC）分子是获得性免疫的重要调节剂。疫苗抗原被B细胞加工成肽片段并呈递在MHC分子上，MHC分子又被辅助T细胞识别。肽结合沟不同，不同的MHC分子所呈递的肽也不同。以前的异源暴露和宿主遗传学的相对贡献还不清楚。

#2

研究思路

Methods

首先测量健康接种个体，同卵双生子和从未感染过流感的婴儿的HAI反应，说明遗传学是导致异质性反应的主要原因；

然后，检测在HA特异性抗体亚型偏倚个体中，接种疫苗后循环CD4+Tfh（cTfh）细胞活化的倍数变化，以探究亚型特异性CD4+T细胞的帮助与抗体亚型偏倚的相关性；

接着，探究表达细胞表面B细胞受体（BCR）的B细胞可结合并主要内化当前疫苗中的同源HA；

还利用小鼠和扁桃体类器官验证偶联异源抗原可限制抗体亚型偏倚；

最后，测试额外的T细胞帮助是否能增强对禽流感HA的反应。

#3

关键结果

Results

1、季节性流感疫苗接种诱导异质性反应，宿主遗传学是异质性反应的主要因素

为了确定疫苗接种反应的变化，研究人员测量了健康接种个体队列中的糖蛋白血凝素抑制（HAI）反应。尽管具有相同的基线HAI滴度，但个体之间的亚型特异性接种后HAI滴度变化很大。又使用统一流形近似和投影（UMAP）进行降维，可视化个体间反应的异质性，结果显示，65.9%接种疫苗的个体被分配到亚型特异性偏倚组（图1A）。偏倚组中疫苗诱导的反应（接种后HAI滴度和倍数）高于制剂中的单个亚型（图1B）。

为了比较过去的暴露和宿主遗传学的相对贡献，测量了同卵双生子队列中的流感疫苗反应（图1C）。结果观察到77%的双胞胎对具有相同的亚型偏倚（图S6）。而且，具有相同亚型偏倚的单卵双生子在接种后对祖先毒株的抗体滴度的倍数变化是不同的（图1D）。这一发现表明，尽管过去暴露的记忆反应不同，双胞胎在接种疫苗后也可能会产生相同的亚型偏好。此外，疫苗接种后对祖先菌株的反应只能部分解释针对季节性疫苗菌株引起的抗体水平（图1E），表明异源既往暴露对疫苗接种后观察到的亚型偏倚的影响是一个因素，但共享遗传学可能是一个更大的因素。然后，研究人员根据每周鼻拭子和低接种前抗HA抗体滴度分析了从未感染过流感的婴儿队列的反应（图1F）。结果显示，73%的婴儿在接种疫苗后出现了偏斜的亚型特异性抗HA抗体反应（图1G）。这一发现表明，遗传学或其他微生物暴露可能是这种现象的主要驱动因素。

图1 宿主遗传学有助于疫苗接种后的流感亚型偏倚。

图S6 与年龄和性别匹配的随机配对的非双胞胎相比，单卵双胞胎中具有相同亚型偏倚的个体比例更高。

2、亚型特异性CD4+T细胞的帮助与抗体亚型偏倚相关

B细胞上的MHC-II分子将抗原衍生肽呈递给T滤泡辅助细胞（Tfh），Tfh是一种为B细胞提供帮助并刺激抗体产生的CD4+T细胞亚群。由于MHC-II分子的肽结合位点可能不同，因此特定MHC-II分子呈递的肽数量的变化可能是B细胞接受T细胞帮助和随后产生抗体反应的主要因素。研究人员使用免疫表位数据库（IEDB）分析了来自H1、H3和B亚型的HA衍生肽的数量。结果发现，MHC-II分子在HA肽的数量上表现出广泛的、亚型特异性的变化，这些HA肽被预测以高亲和力结合（图2A）。使用季节性疫苗制剂中菌株的HA肽刺激这些供体的外周血单个核细胞（PBMC）（图2B）。将制剂中的产酶原肽（H1、H3和B HAs）分成两个独立的库：菌株特异性库和亚型特异性库。结果观察到CD4+cTfh细胞活化的偏倚，其与菌株特异性和亚型特异性肽库的抗体偏倚相匹配（图2CD）。

图2 宿主MHC-II分子的HA肽呈递差异导致接种后CD4+T细胞帮助的偏倚。

3、B细胞可以在共价偶联后内化异源抗原

研究人员假设表达细胞表面B细胞受体（BCR）的B细胞具有亚型特异性，可结合并主要内化当前疫苗中的同源HA。因此，这些B细胞将仅呈递来自一种抗原的肽，这可能由于MHC-II肽呈递的偏倚而限制CD4+T细胞反应（图S10A）。然而，共价偶联来自不同流感亚型的异源HA抗原可能允许B细胞内化整个复合物，并从更广泛的T细胞阵列中募集帮助，以诱导疫苗接种后对多种毒株的抗体反应（图S10B）。

为了产生具有相似量的不同流感亚型的确定的偶联异源抗原，使用分选酶连接系统。研究人员开发了一种替代平台来偶联HA抗原。首先，修饰了2’4-二氧四氢蝶啶合酶（LS），在每个亚基的N末端携带一个五甘氨酸标签（G5 LS）。HA抗原在C末端用LPETG基序修饰以促进分选酶反应（图S12A）。将来自不同亚型的HA分别纯化并反复缀合至功能支架（图S12B）。在随后的缀合循环之前，通过尺寸排阻色谱法纯化每个分选酶反应的产物（图S12C）。偶联的异源HA抗原显示每种流感亚型。HA抗原与功能性支架的缀合也通过负染色电子显微镜证实（图S12D）。这种偶联的异源HA抗原与一组流感特异性单克隆抗体（mAb）的结合，表明正交缀合不影响其天然构象（图S12E）。

接下来监测了偶联的异源抗原在工程化B细胞中的内化，MHC-II上的肽在B细胞中的呈递始于抗原的内吞作用。建立一个表达结合H1 HA但不结合H3或B HA的BCR的B细胞系，结果发现H1 HA特异性B细胞可以在共价偶联后内化H3和B HA（图S13A-C）。

图S10 亚型偏倚模型和通过扩大T细胞帮助克服亚型偏倚的策略。

图S12 共价偶联异源流感抗原的设计与鉴定。

图S13 完整偶联的异源抗原在工程改造的B细胞系中的内化。

4、偶联异源抗原可限制抗体亚型偏倚

C57 BL/6小鼠具有一种MHC II类（I-Ab），研究人员分析了来自不同流感病毒株的HA蛋白，以鉴定被预测与I-Ab结合的高亲和力肽的HA蛋白。然后，用三种不同HA的混合物免疫小鼠。结果显示，免疫小鼠具有与预测的CD4+T细胞帮助一致的明确的抗体亚型偏好。将来自不同毒株的HA组合到一个疫苗平台上以形成偶联的异源抗原限制了这种亚型偏倚（图3A-B）。为了测试人类是否可以克服亚型偏见，又利用人类扁桃体类器官，评估了对偶联异源抗原的抗体反应与单独展示来自多种亚型的HA（HA混合物）的相同平台的抗体反应（图3C）。来自不同供体的类器官培养物的IIV和HA混合物刺激显示亚型偏倚（图3D）。相比之下，用偶联的异源HA抗原刺激的来自相同供体的培养物通常导致针对多种亚型的高抗体反应（图3D）。与IIV相比，用偶联的异源抗原刺激后活化的CD4+Tfh细胞的频率更高（图3E）。这一发现表明偶联的异源抗原增强了CD4+Tfh细胞功能。用Pitstop 2抑制培养物中的内吞作用降低了抗体反应，表明需要抗原摄取（图3F）。

图3 异源HA抗原的共价偶联可以在很大程度上消除亚型偏倚。

5、“借用”T细胞帮助增强禽流感反应

接下来，研究人员测试了是否可以通过提供额外的T细胞帮助来增强对禽流感（H5N1）HA的反应（图4A）。尽管单独用H5N1 HA刺激的扁桃体类器官诱导非常弱的抗体反应，但具有最佳比例的H5N1 HA和季节性HA的偶联异源抗原诱导更高的抗体反应（图4B-C）。使用H5 HA特异性和H1 HA特异性球聚体探针分析抗原特异性B细胞的频率（图4D）。结果显示，与单独用H5 HA刺激相比，用偶联的异源H5和季节性HA抗原刺激后，H5 HA+（菌株特异性）和交叉反应性（H5和H1 HA+）非B细胞的频率更高。偶联异源抗原刺激后，菌株特异性B细胞的频率比交叉反应性B细胞高约5倍。这一结果表明，偶联抗原与不同的序列导致更高的抗体滴度，主要是因为更好的菌株特异性反应，并在很小程度上，交叉反应性反应。

图4 通过借用CD4+T细胞的帮助来增强对禽流感HA的抗体反应。

结论

本研究表明，偶联异源抗原可能会扩大T细胞的帮助，提高疫苗的效应。这种增加T细胞帮助的策略很容易适用于需要多菌株覆盖的其他病原体的疫苗。此外，将免疫原性肽掺入抗原中可能会进一步增强CD4+T细胞反应。而且，免疫类器官提供了一种快速测试疫苗构建体和假设的方法。

参考文献：

Mallajosyula V, Chakraborty S, Sola E, Fong RF, Shankar V, Gao F, Burrell AR, Gupta N, Wagar LE, Mischel PS, Capasso R, Staat MA, Chien YH, Dekker CL, Wang TT, Davis MM. Coupling antigens from multiple subtypes of influenza can broaden antibody and T cell responses. Science. 2024 Dec 20;386(6728):1389-1395. doi: 10.1126/science.adi2396. Epub 2024 Dec 19. PMID: 39700292.

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来源：培养盒守护者