特别关注｜药物性肝损伤的免疫学机制

摘要：药物性肝损伤（DILI）是指由化学药品、生物制品、中成药等按处方药或非处方药管理的药品，以及中药材、天然药物、保健品、膳食补充剂等产品，或其代谢产物乃至其辅料、污染物、杂质等所导致的肝损伤。但关于DILI发生的具体分子机制尚未完全明确，近年来研究表明，多种因素

药物性肝损伤（DILI）是指由化学药品、生物制品、中成药等按处方药或非处方药管理的药品，以及中药材、天然药物、保健品、膳食补充剂等产品，或其代谢产物乃至其辅料、污染物、杂质等所导致的肝损伤。但关于DILI发生的具体分子机制尚未完全明确，近年来研究表明，多种因素协同促使了DILI的发生，即DILI是一个激活细胞死亡信号通路和免疫反应的主动过程，药物反应代谢物、线粒体应激反应和氧化应激参与了DILI的启动。免疫反应在DILI发生及恢复中具有极其重要的意义，但关于其免疫应答因素、免疫细胞分化机制及相关细胞因子的作用等诸多问题需要探究。基于此，本文将就DILI可能涉及到的3种免疫致病机制（遗传与表观遗传因素、抗原识别机制因素、免疫调节失衡因素）的进展进行总结阐述。

1 DILI免疫机制的遗传与表观遗传因素

全基因组研究表明，遗传与表观遗传多样性可导致药物反应和毒性的个体间差异。DILI机制中，细胞色素P450酶、人类白细胞抗原（HLA）相关基因的遗传变异，使得某些患者表现为更显著的DILI易感性。研究发现，HLA-B*13:01既是导致Ⅳ型迟发型超敏反应-氨苯砜超敏综合征的发生基础，也在氨苯砜DILI的发病机制中发挥重要作用。HLA-A*32:01和HLA-B*15:18的基因多态性分别是万古霉素与阿莫西林-克拉维酸导致DILI的重要因素。HLA-B*35:01等位基因对何首乌-DILI的易感性得到了反复验证并被美国肝病学会实践指南采纳；保健品相关DILI中，HLA-B*35:01和绿茶导致的肝损伤也密切相关。一项前瞻性研究显示，二甲基亚硝胺D-脱甲基酶（CYP2E1）变异基因型或谷胱甘肽硫转移酶T1无效基因型的患者出现DILI的风险更高。一项巢式病例对照研究表明，NRF2、KEAP1、MAFF、MAFK基因多态性与抗结核药物所致肝损伤相关。基于DILI损伤机制的基因多态性，Nature Medicine发表了关于多基因风险评分预测DILI的研究，为DILI建立了多基因风险评分系统，并进行了10余种药物验证。尽管很多学者在DILI相关HLA-Ⅰ类和Ⅱ类等位基因方面作了很多研究，但目前学界仍缺乏较高阳性预测值的DILI基因诊断模型。

表观遗传中microRNA、组蛋白修饰、DNA甲基化也与DILI相关。miR-122和miR-192经研究证明在小鼠对乙酰氨基酚（APAP）肝损伤后会显著升高。血清miRNA谱系也对药物诱导的肝脂肪变性和非酒精性脂肪性肝病具有鉴别意义。利奈唑胺和四环素类药物可损害线粒体DNA翻译，从而选择性地减少相应编码蛋白的合成。一项病例对照研究表明，缺氧诱导因子-1基因rs1957757多态性与启动子区域CpG岛甲基化的相互作用和人类抗结核药物诱导的肝损伤风险相关。也有学者利用CRISPR/dCas9对DNA甲基化进行靶向修饰，验证了CYP2D6和CYP2E1的高甲基化与利福平诱导的DILI的相关性。

2 DILI免疫机制的超敏反应机制和P-i假说

药物/代谢物抗原触发免疫性肝损伤，可分为2种类型，即药物诱导的自身免疫性肝炎和药物诱导的超敏反应，且两者在免疫反应模式、细胞因子趋化作用及免疫细胞的分化上存在很大的共性特点。药物超敏机制导致肝损伤主要分为2种：（1）药物-蛋白质复合物在易感人群中，可作为免疫原被抗原呈递细胞摄取，再由主要组织相容性复合体呈递给CD4+T淋巴细胞识别，辅助以细胞因子激活B淋巴细胞产生抗药物抗体；（2）P-i假说：一些药物、代谢成分作为半抗原，能够结合特定的T淋巴细胞受体，刺激T淋巴细胞分泌细胞因子，激活CD8临床研究表明，伴随自身免疫特征的免疫介导的DILI的临床特征与特发性自身免疫性肝炎相似，表现为自身抗体阳性、IgG升高，此类目前学界称之为药物诱导的自身免疫性肝炎。药物-分子复合物作为交叉抗原被机体免疫系统识别，形成自身抗体而导致特异质肝损伤，最常见的模式为药物-蛋白复合物的抗原化及活性代谢物靶向机体的DNA等大分子而形成抗原。英夫利昔单抗导致DILI队列研究证实，64%患者为肝细胞损伤型，69%的患者伴抗核抗体阳性和/或IgG升高。抗体滴度也与DILI的严重程度相关，抗线粒体抗体阳性与Hy’s法则具有显著相关性。巨噬细胞表面表达IgG Fc受体，IgG抗体与靶细胞结合后通过Fc受体介导吞噬细胞的吞噬。有研究证实在APAP相关DILI中巨噬细胞的耗竭会加重其肝脏毒性反应。药物性生物分子作为抗原经抗原呈递细胞提呈后激活CD8+T淋巴细胞，对肝细胞可产生细胞毒作用，临床研究发现BNT162b2 mRNA疫苗导致的DILI组织学特点不同于自身免疫性肝炎以淋巴细胞、浆细胞浸润为主的组织学特征表现，其呈现以CD8-T淋巴细胞分布在整个肝脏小叶为主的病理模式，BNT162b2或通过引发细胞免疫机制导致免疫介导的肝炎。P-i假说认为，药物或药物代谢物可以通过参与迟发性药物反应的不同途径直接、可逆和非共价地与免疫受体结合。药物可以直接结合在T淋巴细胞受体上，促进T淋巴细胞的激活，而不需要多肽和HLA识别，药物或其代谢产物的呈递促进了Th1细胞因子模式（IFN-γ、TNF-α和IL-2）的表达。在相应细胞因子作用下，CD4+T淋巴细胞对可溶性药物-蛋白加合物抗原进行识别，而具有细胞毒作用的CD8+T淋巴细胞可识别肝细胞内特异性抗原。例如，抗原呈递细胞提呈半抗原化的氟氯西林时，表达HLA-B*57:01的患者初始CD45RACD8+T淋巴细胞被激活。特异性的CD8+T淋巴细胞靶向识别HLA-B*57:01背景下的肝细胞内的药物半抗原肽，从而造成氟氯西林相关的肝损伤，但CD8+T淋巴细胞的细胞毒效应，仍然受到CD4+T淋巴细胞和PD-1表达的限制。同样的生物制剂相关DILI中，PD-1单抗造成的DILI中也能看到CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润的组织学特点，其机制或是PD-L1与其受体的结合可以抑制T淋巴细胞迁移、增殖和细胞毒性介质的分泌，从而阻断免疫级联反应；TNF-α单抗相关性DILI的机制或许与TNF-α阻断正常的B淋巴细胞生成，抑制CD8+T淋巴细胞凋亡及TNF-α通过人肿瘤坏死因子受体1刺激效应T淋巴细胞相关］。药物也可以与HLA直接相互作用从而改变HLA所呈现的常规肽结构，形成药物-MHC复合物并导致T淋巴细胞增殖，阿巴卡韦与HLA-B*57:01结合并触发超敏反应则属于此类。

3DILI免疫机制的“危险信号”分子模式及免疫激活限制性条件的减弱

药物可能通过直接或间接形式导致肝内免疫失衡产生自身免疫反应。DILI的机制可通过固有免疫反应中的病原体相关分子模式（PAMP）及损伤相关分子模式（DAMP）发挥作用。药物也可以直接破坏免疫稳态导致DILI，PD-1/PD-L1信号通路、CTLA-4通路及调节性T淋巴细胞在肝脏免疫耐受维持中发挥重要作用。

肠道微生物失调会导致肠道屏障破坏和微生物易位，肠道屏障功能紊乱、肠道通透性的增加也会导致PAMP进入血液，激活Kupffer细胞等免疫细胞上的病原识别受体TLR4等，诱导先天性免疫应答。双歧杆菌能够产生一种短链脂肪酸，可能作为一种新的外源性CYP2E1结合剂，预防药物所导致的急性肝损伤。另有研究表明，肠道菌群的差异可能导致DILI患者临床表型不同，阴道乳杆菌β-半乳糖苷酶释放黄豆苷元能抑制法尼基二磷酸合酶介导的肝细胞铁死亡，从而减轻APAP导致的肝损伤。凋亡和坏死细胞释放的反应性代谢物、肝细胞来源的外泌体或DAMP分子可以激活肝内固有免疫细胞。研究显示，游离DNA成为内源性DAMP，在APAP相关性DILI中通过模式识别受体激活免疫细胞，触发炎症反应。

DILI的固有免疫途径通过Kupffer细胞、树突状细胞上的TLR激活启动固有免疫反应，释放诸如TNF-α和IFN-γ等因子。一些药物还可以促进活化的免疫细胞产生此类细胞因子。IFN-γ已被证明能增强抗原呈递细胞的效应功能，从而促进自身反应性T淋巴细胞的分子模拟和表位扩散，并增强病理性免疫反应。IFN-γ介导T淋巴细胞杀伤肝细胞，CD8+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞以及NK细胞等均可产生和释放IFN-γ，IFN-γ通过激活涉及STAT-1和IRF-1有关的细胞死亡通路来杀死细胞；IFN-γ还可以通过自分泌或旁分泌激活CD8+T淋巴细胞来杀死肝细胞。对于T淋巴细胞亚群的研究目前较少，非致病性Th17是组织稳态的关键调节因子，致病性Th17是自身免疫性炎症的驱动因素，Th22是来源于Th17谱系的特殊亚型，Th17及Th22均可产生IL-22因子，谢青教授团队发现：在DILI发病过程中，IL-22因子与损伤程度呈负相关，但与肝细胞恢复程度呈正相关。笔者认为该研究对Th22及其效应细胞因子的研究将为深入研究DILI的免疫病理学机制提供新的思路，即如何研发出针对导致DILI的Th17同时又需要使具有保护性功能的Th17细胞亚群不被损伤。

调节性T淋巴细胞是机体主要维持自身耐受，平衡免疫稳态的抑制性免疫细胞。APAP诱导的小鼠肝损伤主要是CD4+T淋巴细胞亚群发挥作用而非CD8+T淋巴细胞，进一步研究表明Th1和调节性T淋巴细胞亚群参与调节APAP诱导的肝损伤。PD-1/PD-L1、CTLA-4的表达和生物学功能对于调节T淋巴细胞反应具有重要意义。细胞毒性T淋巴细胞在免疫治疗相关肝炎的发病机制中起核心作用，其机制为细胞毒性CD8+T淋巴细胞导致肿瘤细胞破坏，以及肿瘤抗原、新抗原和自身抗原释放。这被称为表位传播并导致免疫耐受性降低。这种效应与Th1和Th17的激活一起导致诸如IFNγ和IL-17促炎细胞因子的产生，从而促使DILI发生。免疫检查点抑制剂引起细胞毒性T淋巴细胞再激活、自身抗原异常呈递、肝脏免疫耐受环境被破坏和细胞因子分泌等效应，从而导致DILI。

4 小结

在遗传易感性及表观遗传基础上，一方面药物/代谢物、药物-分子复合物通过超敏反应机制及“P-i”机制触发以适应性免疫介导的肝损伤；另一方面“危险信号”分子模式PAMP、DAMP或可引发出特定的固有免疫细胞反应进而级联适应性免疫导致DILI的发生。此外，诸如PD-1机制、CTLA-4机制的免疫调节因素的失衡，亦可能在DILI中产生作用（图1）。DILI免疫致病机制问题的深入研究极其重要，无论是对于AIH的鉴别还是DILI靶点药物的开发都极具意义。DILI的免疫发生机制也能体现DILI的特异质性、病程及不同病例用药后发生损伤事件的时间差异。希望能在后续研究中对围绕DILI机制中的免疫细胞亚群、炎症通路、细胞因子、趋化因子及表观遗传学中的HLA基因进行系统而深入的发掘。探索肝脏在DILI机制免疫耐受平衡中受到的影响，从而规避相应的药毒风险，为药物的开发及合理用药提供依据。