摘要：结核病是单一传染病中的头号杀手,长期以来对人类健康带来了巨大威胁。据2019年世界卫生组织(WHO)报告,全世界约有1/4人口感染结核分枝杆菌(Mycoplasma pneumoniae ，MTB), 每年全球结核病新增患病人数超过1000万人次, 且以肺结核

结核病是单一传染病中的头号杀手,长期以来对人类健康带来了巨大威胁。据2019年世界卫生组织(WHO)报告,全世界约有1/4人口感染结核分枝杆菌 (Mycoplasma pneumoniae ，MTB), 每年全球结核病新增患病人数超过1000万人次, 且以肺结核最为常见。随着耐药结核菌株增加,人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核双重感染患者逐年增多, 每年因结核病死亡人数超过180万。

根据WHO统计，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。由于缺乏有效疫苗，缺乏高特异性和敏感性诊断试剂，且耐药性结核病的不断涌现等原因，该病仍然是全球公共卫生的重大威胁。因此早期快速确诊及治疗是控制结核病传播的关键。

目前肺结核的诊断主要依靠患者症状、胸部影像学检查及痰涂片抗酸染色和痰 MTB 培养。然而，肺结核患者症状及影像学检查往往缺乏特异性，痰涂片抗酸染色法检查敏感性和特异性都很低，很多时候会导致漏诊；痰 MTB 培养耗时长，以上检测手段难以满足早期快速诊断肺结核的要求。随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子诊断方法被应用于结核病临床诊断。

WHO支持的和新出现的结核病和耐药性分子检测。蓝色勾勒的是WHO支持的NAAT，包括LPA、Xpert Ultra、LAMP和Truelab。尚未得到世界卫生组织批准但正在开发或评估的测试用橙色标识。所示图片是每个类别中的产品示例。

2017 年我国颁布的《「十三五」全国结核病防治规划》中明确提出分子生物学检验阳性可以辅助确诊肺结核。就在上周，国家疾控局、国家卫健委、国家发改委、教育部、公安部、司法部、财政部、医保局、药监局等9部委联合发布《 全国结核病防治规划（2024—2030年） 》，旨在全面加强结核病防治工作，终结结核病流行，并且将分子检测技术作为首选诊断手段！

本文主要总结近年来几项具有代表性的肺结核分子诊断方法及进展,为更先进的MTB分子诊断检测开发提供参考。

qPCR

以美国Cepheid公司研发的GeneXpert MTB/RIF为代表，依靠全自动GeneXpert平台自动提取样本中的MTB DNA,并以rpoB基因为靶点进行直接扩增。rpoB基因突变时会导致细菌对RIF耐药,绝大部分利福平（rifampicin， RIF）耐药MTB都由该基因突变导致。因此,该技术可用于检测MTB及其对RIF耐药性。

GeneXpert MTB/RIF

由于RIF耐药 MTB常合并异烟肼(INH)耐药,因此该技术也在多耐药 MTB 诊断中发挥重要作用。GeneXpert MTB/RIF 检测样本极限低 (痰液标本 112.6CFU/mL),可直接检测新鲜痰液、纤支镜灌洗液、淋巴结针吸液等标本,检测灵敏度高。另外,该技术生物安全性高,普通实验室条件即可满足检测需求,操作简便,2小时可自动获得检测报告。

2010年,WHO极力推荐GeneXpert MTB/RIF作为结核病常规诊断工具, 其被誉为结核病诊断突破性检测技术。

2013年, WHO推荐HIV合并疑似结核病患者优先使用GeneXpert MTB/RIF检测。

2018年,一项关于该技术的肺外结核病诊断效应的meta分析结果显示, GeneXpert MTB/RIF诊断肺外结核同样表现出色, 对不同肺外结核的灵敏度有差异,但诊断特异度及RIF耐药检测准确性都很高。GeneXpert MTB/RIF技术优点如此之多,可在有条件的实验室广泛开展,但基层医疗卫生机构及条件落后地区开展此项技术可能受限。

随后, Cepheid研发的GeneXpert MTB/RIF Ultra系统问世,其作为GeneXpert MTB/RIF的升级版,在原技术的基础上仅需额外下载一款应用软件,其余操作相同。GeneXpert MTB/RIF Ultra对痰液样本检测极限更低 (15.6CFU/mL),灵敏度、RIF耐药检出率更高,但特异度稍降。

2017年,WHO推荐GeneXpert MTB/RIF Ultra用于检测痰检阴性者、肺外结核病标本及儿童结核病,可取代GeneXpert MTB/RIF。

就在上周四（12月5日），WHO宣布GeneXpert MTB/RIF Ultra已通过预认证流程，成为首个符合WHO在质量、性能及安全标准方面的结核病及抗生素敏感性诊断检测工具。

来源 WHO官网新闻稿

LPA是将PCR扩 增、反向杂交、膜显色技术结合的快速分子诊断技术。尽管LPA检测MTB DNA操作较GeneXpert MTB/ RIF复杂,且需1~2天获得结果,但LPA 除可检测RIF耐药性外,还能检测INH耐药(KatG、inhA 基因突变)。

德国Hain Lifescience公司开发了试剂盒 GenoType® MTBDR。2008年,WHO推荐采用 GenoType® MTBDR检测痰检阳性标本中MTB的RIF及INH 耐药性,但不能检测二线抗结核药。随后,二代产品GenoType® MTBDR plus系列问世。

研究显示, GenoType® MTBDR plus2.0对结核病诊断的灵敏度为68.4%,特异度为89.3%,但诊断 RIF耐药性的灵敏度和特异度分别为 100.00%和99.24%,诊断INH耐药性的灵敏度和特异度分别为97.62%和98.55%。

随后,该公司和日本Nipro公司合作研发了Nipro NTM+MDRTB,可检测MTB对氟喹诺酮、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉 素和乙胺丁醇的耐药性。

2017年,有学者对GenoType® MTBDR plus及 Nipro NTM+ MDRTB进行评估,结果显示,LPA对痰检阳性者的诊断灵敏度为94%,对痰检阴性者的诊断灵敏度仅为44%。LPA对RIF耐药性的诊断灵敏度为96.7%,特异度为98.8%;NIH耐药的诊断灵敏度为90.2%、特异度为99.2% 。

因此,LPA能够快速、准确、高效鉴定痰检阳性患者的耐药性;对于痰检阴性的肺结核患者应当综合其他检测手段。WHO推荐LPA应在条件较高的实验室中完成。

间隔区寡核苷酸分型技术（Spoligotyping）

Spoligotyping基于PCR、反向杂交膜印迹技术直接分析 MTB DNA特有的直接重复区(DR)来对寡核苷酸进行分析,从而分型MTB复合群基因型。该方法是公认的MTB菌种鉴定方法,具有检测价格较低、高通量、与其他MTB基因标志物关联性好等优点。

由于长期以来,全球各实验室共享利用该技术分析数据,因此庞大的MTB寡核苷酸序列国际数据库得以建立。但传统Spoligotyping技术缺点明显,如操作复杂、耗时长、检测设备较难获得、人工判读检测结果 存在一定误差等。

近年来,该技术与qPCR探针溶解曲线技术相结合的新型间隔区寡核苷酸分型技术(McSpoligotyping)问世,其操作简化、获得结果快速、检测结果由计算机判读。2013年,厦门至善公司推出了基于该法的商业化试剂盒,应用于MTB菌种鉴定RIF、INH 耐药性检测。

结核分枝杆菌复合物分子流行病学的孢子分型

研究表明,McSpoligotyping对MTB菌种的鉴定具有良好一致性,且其更简便的操作程序利于MTB流行病学研究。该类技术与较传统培养法相比,具有获得检测结果快速、操作简便、设备不复杂等优点,因此可作为MTB菌种鉴定及MTB耐药性检测的诊断工具推广。

环介导等温扩增（LAMP）

LAMP可在恒温、不需要热循环条件下直接对MTB DNA 进行扩增，且具有操作简便、检测设备不复杂、实验室条件要求低、全封闭环境下检测、诊断灵敏度及特异度高等优点,但其对涂片阴性患者的诊断灵敏度明显下 降(52.1%~90.3%),存在假阳性。

LAMP与GeneXpert MTB/RIF的诊断效应对比结果显示,GeneXpert MTB/RIF的诊断灵敏度和特异度分别为86.6%、97.4%,而LAMP的诊断灵敏度和特异度分别为84.6%、98.4% ，高度一致。2016年,WHO推荐LAMP可成为痰涂片替代技术,用于可疑结核病的筛查, 对于基层医疗卫生机构或检测资源较差地区, LAMP将成为结核病的主要诊断方法。

基因芯片

MTB与NTM临床特征相似、易混淆,但治疗方法不同,因此早期区分二者尤为重要。MTB耐药性检测对及时、有效治疗结核病具有重要意义。基因芯片技术正是可以兼顾 MTB菌种鉴定与耐药性检测的新型高通量自动化核酸检测技术,其基本原理为将DNA、cDNA等不同探针固定于基质后形成微阵列,然后与目标核酸(DNA、RNA) 杂交,进一步检测每个探针分子杂交信号强度获取标本中分子数量与核酸信息从而鉴定菌群。通过检测ropB、katG、inhA3种基因的常见位点突变鉴定MTB对RIF、INH的耐药情况。

基因芯片技术可一次性分析大量基因,极大提高了检测效率,同时还能够快速、 准确地获得检测结果(4~5h),且重复性及生物安全性也高。国内研究显示,该方法对 MTB耐药性及MTB菌种检测的诊断灵敏度、特异度与培养法具有较高一致性。研究显示,基因芯片技术、LPA、GeneXpert MTB/RIF检测MTB对RIF耐药性均表现出色,适用于临床。

相较于LPA不能鉴定菌种及GeneXpert MTB/RIF不能检测INH耐药性,基因芯片技术具有明显优势,但其检测成本较高、设备昂贵、试验操作步骤较复杂,因此在基层医疗卫生机构及条件落后地区开展较困难。

NGS

基因测序技术日渐成熟,被世界公认为MTB DNA及耐药性检测的最终分子诊断方法，不同于其他分子检测方法（检测范围受限于特定探针目标），NGS检测能够迅速、全面获得MTB对现有所有抗结核药物耐信息,（如全基因组测序，WGS）或多个感兴趣基因区域的序列信息（如目标NGS，tNGS），对结核病患者个体化抗结核治疗及多重耐药结核病的控制具有重大意义。另外,WGS在结核病分子流行病学、多重耐药结核菌传播及MTB耐药性演变的研究中发挥着重要作用。

2019年，WHO建立了一个名为ReSeqTB的结核测序数据库，用于整理、标准化和统一DST相关的基因型和表型数据，以及耐药性结核（DR-TB）的元数据。其中一种已上市的tNGS检测方法是Deeplex Myc-TB（法国里尔Genoscreen公司开发），通过超深度测序24种扩增子混合物实现分枝杆菌种类鉴定、基因分型和DST。

目前，NGS已成功在至少七个国家用于耐药性结核监测：阿塞拜疆、孟加拉国、白俄罗斯、巴基斯坦、菲律宾、南非和乌克兰。在一些结核病低负担国家的医疗体系中（如英国公共卫生部门、荷兰和纽约州），已经从表型培养转向使用WGS进行一线药物的DST。美国疾病控制与预防中心对全国所有培养确认的结核病例进行测序。更多国家正在考虑采用基于测序的方法进行药物敏感性监测。例如，印度最近表示有兴趣将测序技术用于监测和临床护理。

迈迪安开发MTB分子检测原料

迈迪安推出的Saliva-specific唾液直扩qPCR/LAMP预混液可用于从高达20%痰液样本中直接、快速进行结核肺支杆菌检测，无需进行核酸提取步骤，是用于开发快速MTB分子检测的理想选择。其独特的优化配方对痰液样本中存在的抑制物有超高的耐受性，并且可以兼容qPCR扩增仪的快速循环设置，最快可在15分钟完成检测。除此以外，该配方含有优化的冻干或风干赋形剂，既可以用于液体体系，也可以通过冻干或风干开发成常温稳定的检测。

对高达20%痰液样本中MTB快速qPCR扩增

含有20%痰液的结核分枝杆菌DNA样本，在QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR仪上分别使用(A)标准qPCR循环条件，和(B) 仪器上配的最快循环条件进行扩增。结果显示，在标准和快速qPCR循环条件下，可风干唾液直扩qPCR预混液的性能和荧光强度(蓝色)都优于KAPAProbe Force (Roche, 绿色)和Ultraplex™ (QuantBio,灰色)。标准循环设置：3 分钟 @ 95ºC, 10 秒 @95ºC + 25 秒 @ 60ºC，40个循环；快速循环设置：3 分钟 @ 95ºC, 1 秒 @95ºC +1 秒 @ 60ºC，40个循环。

文章内容来源：

1. WHO 官网

2. 肺结核分子诊断方法研究进展，DOI:10.3969/j.issn.1009-5519.2020.22.017

来源：小桔灯网