摘要：肠上皮细胞表达主要的组织相容性复合体（MHC）II类分子，但没有证据表明MHC II在乳糜泻背景下能够呈递麸质抗原来激活CD4+T细胞。活动性乳糜泻患者表现为十二指肠上皮MHC II表达增强。然而，麸质-MHC II与CD4+T细胞相互作用的机制仍有待确定。肠
肠上皮细胞表达主要的组织相容性复合体（MHC）II类分子，但没有证据表明MHC II在乳糜泻背景下能够呈递麸质抗原来激活CD4+T细胞。活动性乳糜泻患者表现为十二指肠上皮MHC II表达增强。然而，麸质-MHC II与CD4+T细胞相互作用的机制仍有待确定。肠上皮细胞在激活CD4+T细胞中的免疫作用是乳糜泻发病机制的核心，发现这一作用将开辟针对这一途径及其环境决定因素的新药物开发路线。肠上皮细胞作为麸质特异性CD4+T细胞的功能性抗原呈递细胞一直被忽视，并可能在乳糜泻中定位并进一步增加麸质特异性CD4+T细胞对上皮的损伤。
文章介绍
题目：MHC II类表达上皮细胞对CD4+T细胞的麸质依赖性激活
杂志：Gastroenterology
影响因子：IF=25.7
发表时间：2024年7月
#1
研究背景
Background
乳糜泻(CeD)的全球患病率约为1%，是一种免疫介导的全身性疾病，在遗传易感个体中由麸质沉淀。CeD的特征是麸质依赖性小肠绒毛萎缩、隐窝增生、上皮内淋巴细胞增多、麸质依赖性转谷氨酰胺酶2（TG2）特异性自身抗体和优先针对麸质的持续适应性免疫反应。特定的MHC II基因是必需的，但对于CeD来说是不够的，并且涉及辅助因子。90%的CeD患者携带编码HLA-DQ2.5蛋白的HLA-DQA1*05和HLA-DQB1*02，由B细胞和树突状细胞等专业抗原呈递细胞表达。在HLA-DQ2.5阳性CeD患者中，HLADQ2.5可使特异性CD4+T细胞识别一组独特的麸质——蛋白酶抗性麸质。HLA-DQ2.5阴性的患者通常为HLA-DQ8阳性，HLA-DQ8也可能出现一组特征性的麸质。
麸质包括小麦、黑麦和大麦中的脯氨酸蛋白，其中小麦麦胶蛋白是最具特征的组分。小麦麦胶蛋白在人肠道内被宿主和微生物蛋白酶部分消化，从而使具有免疫原性的蛋白酶抗性麸质通过与CD71连接的分泌型IgA介导的跨细胞作用穿过上皮。TG2介导的选择性脱酰胺增强了免疫原性麸质与HLADQ2.5分子结合的亲和性。
肠上皮细胞通过表达继发于炎症和感染的应激诱导标志物，并通过释放TG2到肠腔生成TG2-麸质复合物，在CeD发病机制中发挥关键作用。最近的一项研究表明，TG2和麦胶蛋白特异性B细胞和浆细胞是固有层中麦胶蛋白的首选抗原呈递细胞。肠上皮细胞表达MHC II，而促炎刺激可以上调肠上皮细胞中的MHC II，但这种表达对CeD的功能影响尚未得到证实。在本研究中，在CeD患者和缺乏小鼠MHC II分子并转基因表达人DR3-DQ2.5的麸质免疫小鼠中研究了CeD相关MHC II的上皮表达。还进一步分析了导致麸质依赖性CD4+T细胞活化的条件。
#2
研究思路
Methods
1、活动性和经治疗的CeD以及未免疫和麸质免疫的DR3-DQ2.5转基因小鼠（缺乏小鼠MHCII分子）中测定肠上皮细胞中的MHC II；
2、类器官单层-CD4+T细胞共培养体系验证肠上皮细胞能够在麸质存在下激活CD4+T细胞；
3、探究铜绿假单胞菌产生的弹性蛋白酶预消化麸质对增强CD4+T细胞的增殖和激活的影响；
#3
关键研究结果
Results
1、活动性CeD患者IEC中MHC II表达较高
通过评估肠上皮细胞（IEC） MHCII的表达，确定CeD活性对IEC MHC II表达的影响。活动性和治疗期患者的切片均显示固有层内有MHC II免疫染色。与经治疗CeD患者相比，在活动性CeD患者的IEC中显著观察到MHC II表达，这提示炎症增加与较高的上皮MHC II表达相关。同型对照组未检测到染色。流式细胞术检测发现CeD患者的IEC表达HLA-DQ亚型，以及CD40、CD80和CD86。总之，这些数据揭示了在CeD中，IEC表现出抗原呈递细胞的特征。
图1 CeD活性表明IEC中MHC II分子表达水平较高
2、麸质免疫诱导DR3-DQ2.5小鼠MHC II表达
为了分析CeD患者IEC中MHC II表达的功能后果，使用了携带人类CeD风险基因DR3-DQ2.5的转基因小鼠，并评估了麸质免疫后的小肠炎症。与非免疫（NI）小鼠相比，麸质免疫小鼠的血清抗TG2 IgG较高，小肠抗麦胶蛋白IgA较高，小肠绒毛-隐窝比值降低，CD3+上皮内淋巴细胞计数较高。小肠中的基因表达分析显示，在麸质免疫小鼠和NI小鼠之间有22个基因差异表达。与固有免疫功能相关的基因，如Rhoa、Tollip和MAPK，在麸质免疫小鼠中过表达。在麸质免疫的小鼠中，其他炎症相关基因（如Il15、Il1a、Tir3和Cfb）的表达高于NI小鼠。通过免疫荧光染色和流式细胞术评估，麸质免疫小鼠的IEC MHC II表达也高于NI小鼠。同型对照组未检测到染色。为了研究体内诱导的炎症是否导致更强的小肠MHCII表达，麸质免疫小鼠注射IFN-γ。在只有固有层MHC II+细胞的对照小鼠中，麸质免疫+IFN-γ注射小鼠的上皮MHC II和Cd74 mRNA表达高于对照组。
图2 麸质免疫诱导DR3-DQ2.5小鼠炎症和MHC II表达。
图3 IFN-γ注射和麸质免疫增强DR3-DQ2.5-hCD4小鼠上皮MHC II的表达。
3、麸质免疫和IFN-γ诱导类器官单层细胞中MHC II和共刺激分子表达
从正常小鼠的十二指肠和近端空肠构建类器官单层细胞，并验证了主要肠上皮谱系标志物的表达。E-cadherin染色证实存在黏附连接，提示上皮极性。DR3-DQ2.5和HLA-DQ8小鼠的肠上皮细胞均含有Mucin2杯状细胞、Chromogranin A肠内分泌细胞、Villin1肠上皮细胞和Lysozyme潘氏细胞。然后使用麸质免疫小鼠、NI小鼠和naïve DR3-DQ2.5小鼠的单层类器官研究上皮MHC II的表达。与NI或naïve小鼠的单层类器官相比，来自麸质免疫小鼠的单层类器官显示MHC II分子表达增强。随后确定了IFN-γ（CeD中麸质特异性CD4+T细胞分泌的细胞因子）对IEC表达MHC II的影响。体外IFN-γ处理增加了NI小鼠单层类器官中MHC II的表达，而在麸质免疫的DR3-DQ2.5和HLADQ8小鼠单层类器官中，MHC II的表达进一步上调。野生型小鼠的单层类器官没有MHC II表达，表明人MHC II抗体与小鼠MHC II分子没有交叉反应。与naïve和NI小鼠相比，麸质免疫+IFN-γ注射小鼠的单层细胞中MHC II表达水平更高，体外IFN-γ处理进一步上调MHC II表达水平。在麸质免疫+IFN-γ注射小鼠的单层细胞中Cd74和Ciita的表达较高，在体外IFN-γ刺激后进一步增加。
接下来研究了经典共刺激分子CD80、CD86和CD40的表达，除了与MHC II结合的抗原外，这些分子也是激活CD4+T细胞所必需的。麸质免疫后单层类器官中CD40的表达高于NI或naïve小鼠单层类器官。IFN-γ处理可增加麸质免疫小鼠单层类器官CD40、CD86和CD80的表达，但对NI和未处理小鼠单层类器官无明显影响。使用麸质免疫HLA-DQ8小鼠的单层类器官也获得了类似的结果。这些结果表明，共刺激分子的表达需要多种炎症刺激，如体内麸质免疫和IFN-γ环境提供的刺激。还评估了在DR3-DQ2.5小鼠的单层细胞中Qa-1和CD71的表达。与培养基处理的麸质免疫小鼠、NI的类器官单层或naïve小鼠的类器官单层相比，经IFN-γ刺激的麸质免疫小鼠的单层类器官CD71和Qa-1表达较高。因此，在诱导的体内或体外炎症条件下，来自DQ2.5或DQ8小鼠的类器官单层表达MHC II和参与IEL活化和跨上皮转运的标志物。
图4 麸质免疫和IFN-γ诱导DR3-DQ2.5小鼠类器官单层MHC II的表达。
图5 麸质免疫+IFN-γ注射DR3-DQ2.5-hCD4小鼠类器官单层中MHC II的表达。
4、MHC II单层类器官以麸质依赖性方式激活hCD4+T细胞
CeD的免疫应答是CD4+T细胞依赖性和HLA-DQ限制性的。为了研究MHC II与CD4+T细胞之间的相互作用，除了使用DQ2.5外，还使用了T细胞上携带有功能性人类CD4受体（DR3-DQ2.5-hCD4）的小鼠。利用表达MHC II的麸质免疫DR3-DQ2.5小鼠的单层类器官与麸质免疫DR3-DQ2.5-hCD4小鼠的脾脏CD4+T细胞建立共培养体系。IFN-γ处理的表达MHC II的单层类器官用DAPT-麦胶蛋白，DAPT-zein或培养基进行顶端刺激，然后将hCD4+T细胞引入单层类器官的基底外侧。hCD4+T细胞的增殖在DAPT-麦胶蛋白刺激下比DAPT-zein处理增加了2.5倍。用DAPT-麦胶蛋白(而不是DAPT-zein)刺激单层细胞增加了共培养上清液中几种细胞因子和趋化因子的分泌。这些数据表明，表达MHC II的单层上皮以一种麸质依赖的方式诱导潜在的hCD4+T细胞的增殖和活化，导致一组CeD相关细胞因子和趋化因子的分泌增加。
图6 表达MHC II的单层类器官诱导麸质依赖性CD4+T细胞反应。
5、条件病原体衍生的弹性蛋白酶对hCD4+T细胞活化的调节
微生物因子已成为CeD炎症的调节因子。之前的研究表明，由细菌弹性蛋白酶代谢的麸质具有增强的免疫原性。为了研究细菌代谢是否影响IEC与T细胞间的相互作用，使用经产弹性蛋白酶的野生型（WT）铜绿假单胞菌PA14预消化的麦胶蛋白刺激单层类器官与CD4+T细胞共培养。将DAPT-麦胶蛋白、缺乏弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌等基因lasB突变株(称为lasB△/△)预消化的麦胶蛋白和野生型PA14上清液作为对照。与使用lasB△/△ DAPT-麦胶蛋白预消化的共培养物或WT铜绿假单胞菌PA14上清液处理的共培养物相比，使用WT铜绿假单胞菌PA14预消化的DAPT-麦胶蛋白处理的共培养物分别使hCD4+T细胞增殖增加2.6倍。活化标志物CD69、CD25和CD44在hCD4+T细胞中的表达增加，证实了与对照组相比，这些细胞在用WT铜绿假单胞菌PA14预消化的DAPT-麦胶蛋白刺激的共培养中具有更强的活化表型。这与一系列细胞因子和趋化因子的水平升高有关，包括当类器官单层分别用lasB△/△、DAPT-麦胶蛋白或WT铜绿假单胞菌PA14上清酶预消化的DAPT-麦胶蛋白处理时，上清液中IL-2水平增加了676倍。这些结果表明，当麦胶蛋白被细菌弹性蛋白酶部分代谢时，单层类器官表达的MHC II能够使潜在的hCD4+T细胞更强劲的增殖和活化。
图7 由条件性病原体衍生的弹性蛋白酶代谢的麸质可诱导强大的CD4+T细胞反应。
小结
IEC损伤是CeD的标志。然而，其在麸质依赖性T细胞活化中的作用尚不清楚。该研究挖掘了在表达人类MHC II 的单层类器官中IEC-麸质-T细胞的相互作用，该作用有助于CeD中CD4+T细胞识别麸质抗原。该研究发现活动性CeD患者和麸质免疫的DR3-DQ2.5小鼠显示上皮MHC II表达。麸质免疫的DR3-DQ2.5小鼠的类器官单层表达MHC II, IFN-γ可上调MHC II表达。在类器官单层T细胞共培养中，麸质增加了CD4+T细胞的增殖、T细胞活化标志物的表达，以及共培养上清液中IL-2、IFN-γ和IL-15的释放。麸质可被铜绿假单胞菌代谢，促进CD4+T细胞增殖和活化。综上，表达MHC II的IEC有效提呈麸质抗原，导致CD4+T细胞活化，而微生物弹性蛋白酶对麸质的预消化增强了这一活化。针对IEC的治疗可能为调节CeD患者的适应性和固有免疫提供一种新方法。
参考文献
Rahmani S, Galipeau HJ, Clarizio AV, Wang X, Hann A, Rueda GH, Kirtikar UN, Constante M, Wulczynski M, Su HM, Burchett R, Bramson JL, Pinto-Sanchez MI, Stefanolo JP, Niveloni S, Surette MG, Murray JA, Anderson RP, Bercik P, Caminero A, Chirdo FG, Didar TF, Verdu EF. Gluten dependent activation of CD4+ T cells by MHC class II-expressing epithelium. Gastroenterology. 2024 Jul 15:S0016-5085(24)05211-9. doi: 10.1053/j.gastro.2024.07.008. Epub ahead of print. PMID: 39128638.
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来源：培养盒守护者