用于任意图案化声学生物组装的软光刻定义模板

摘要：声学生物组装最近被认为是一种高效的生物制造工具，可用于生成功能性组织模拟物。尽管声学生物组装技术能够直接对细胞间距离很近的活细胞进行图案化，但目前大多数声学生物组装技术仅限于生成某些特定简单类型的周期性和对称性图案，这对于模拟人体组织中几何复杂的细胞结构提出了

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声学生物组装最近被认为是一种高效的生物制造工具，可用于生成功能性组织模拟物。尽管声学生物组装技术能够直接对细胞间距离很近的活细胞进行图案化，但目前大多数声学生物组装技术仅限于生成某些特定简单类型的周期性和对称性图案，这对于模拟人体组织中几何复杂的细胞结构提出了迫切的挑战。

为了应对这一挑战，来自武汉大学的陈璞教授展示了一种软光刻定义的声学生物组装(SLAB)技术，该技术能够将活细胞组装成几何定义的任意多细胞结构（图1）。具体而言，作者利用软光刻来生成基于聚二甲基硅氧烷PDMS构造的振幅调制模板(AMT)，该模板可确定近场声波的压力。通过数值和实验研究了PDMS顶层、空气层和生物颗粒大小对声学生物组装模式的影响。作为概念验证，作者利用这种技术制造了肝组织模拟物(LTM)，并对形成的LTM进行了功能评估，包括白蛋白分泌、尿素合成糖原储存和脂质积累。SLAB能够将细胞组装成精确的模式，从而促进适当的细胞-细胞和细胞-基质相互作用，从而形成具有改进功能的组织结构。相关研究成果以“Soft-lithographically defined template for arbitrarily patterned acoustic bioassembly”为题于2024年12月10日发表在《Biofabrication》上。

图1 SLAB的方案概述

1.声波的数值模拟

作者利用数值模拟研究了AMT尺寸对声学生物组装模式的影响。具体来说，AMT设计有一个圆形充气单元阵列，PDMS顶层厚度为10 µm，空气层厚度为50 µm。数值模拟表明，当声波波长为PDMS顶层和空气层厚度的10倍或以上（f = 1, 2, 3 MHz）时，声压节点（即压力零点区域）与充气单元的设计相重叠。

当声波波长小于PDMS顶层或空气层厚度的10倍时，压力节点不覆盖预先设计的充气单元（图2A）。3D建模和仿真进一步说明充气单元为压力零点，导致在PDMS顶层表面的充气单元上方存在近场声压零点（图2B）。此外，声流体速度场的数值模拟表明，声流体在充气单元的边缘形成微涡旋（图2C），表明微粒倾向于聚集在充气单元边缘正上方的PDMS顶层。

考虑声辐射力和声流体剪切力的假设，随着生物组装室内微粒数量的增加，微粒将首先占据充气单元边缘上方的位置，然后占据充气单元中心上方的位置。我们观察到模拟的压力节点与微粒组装模式重叠（图2D）。此外，定量图像分析也表明压力井是高度一致的粒子聚集区域（图2E），证实SLAB属于声节点生物组装。

图2 声波的数值模拟

2.微粒组装实验

通过优化AMT的PDMS顶层和空气层后进行的微粒组装实验验证了模拟结果。作者首先研究了SLAB对不同直径微粒的组装能力。结果表明，当微粒尺寸小于目标图案尺寸时，微粒可以有效地组装在目标图案的顶部。微粒组装实验进一步证实，无论图案大小如何，10 µm大小的微粒都能组装在目标图案的顶部。数值模拟表明，无论对称还是非对称，声压节点区域都能与目标模式很好地吻合（图3A和B）。设计了对称和非对称的人体仿生结构，以评估SLAB在构建任意目标模式方面的多功能性，包括肝小叶、肌纤维、骨单位和微血管（图3C–F）。粒子跟踪分析进一步表明，AMT上最初随机分布的微粒被迅速捕获在声压节点区域，形成紧密排列的粒子聚集体；微粒组装实验进一步验证了91.6%的微粒组装到目标模式区域上。

图3 对称与非对称仿生结构微粒组装

3.使用SLAB构建LTM

肝脏组织以肝小叶为基本功能单位，肝细胞索和肝血窦围绕中央静脉呈放射状排列，形成六边形异质细胞结构（图4A）。LTM由肝细胞与内皮细胞球体声学组装后经 7 d组织培养生成（图4B）。在超低粘附琼脂糖微孔阵列中，摇床动态培养4 d生成内皮细胞球体。球体平均直径达到143 ± 5.83 µm。内皮细胞球体按预先定义的放射状组装，肝细胞包围内皮细胞球体。通过细胞活力测定评估SLAB的生物相容性。死细胞经PI染色后呈现红色荧光，而总细胞核经DAPI染色后呈现蓝色荧光（图4C）。组装前后细胞活力无明显差异，表明组装过程及后续培养对细胞活力无影响（图4D）。

此外，在组装后第1天和第7天对LTM进行了细胞追踪分析。结果显示，内皮球体组装到肝小叶图案的径向区域，而肝细胞紧密包裹内皮细胞并填充组装腔的其余区域。作者还发现内皮球体和肝细胞在7天内融合成大块微组织。形成的LTM模拟了天然肝小叶结构，使肝实质细胞和支持细胞之间能够直接接触（图4E）。

图4 使用SLAB构建LTM

4.LTM的功能评估

为评估LTMs的肝脏代谢合成功能，作者在第2、4、6天检测了白蛋白分泌和尿素生成情况。LTMs的白蛋白分泌和尿素生成在第6天达到最低水平。与未组装组相比，SLAB组在第6天的白蛋白分泌（图5A）和尿素分泌（图5B）的分泌功能有所改善。此外，PAS和尼罗红染色显示LTMs具有肝脏特异性功能，包括糖原储存和脂质蓄积（图5C-D）。