摘要：正如高教授所介绍的，今天我要介绍我们一直在做的工作，即开发腺相关病毒（AAV）治疗中枢神经系统（CNS）疾病的平台，并尽我们所能去快速扩展该平台，使其他人可以更容易地做我们正在做的事情。前面几位讲者已经介绍了AAV载体，这部分我不再赘述，我将用更多时间介绍其他

讲者

Steven J. Gray

得克萨斯大学西南医学中心儿科副教授

感谢高教授的介绍以及主办方的邀请，这是我第一次来中国，受到热情的招待，我感到非常开心。我也很惊喜地看到中国在科研领域的杰出进展，很高兴能来到这里。

正如高教授所介绍的，今天我要介绍我们一直在做的工作，即开发腺相关病毒（AAV）治疗中枢神经系统（CNS）疾病的平台，并尽我们所能去快速扩展该平台，使其他人可以更容易地做我们正在做的事情。前面几位讲者已经介绍了AAV载体，这部分我不再赘述，我将用更多时间介绍其他内容。

AAV9能够精准递送吗？

针对AAV的不同血清型，刚才高教授对AAV9已经做了讲解，实际上，这也是用于中枢神经系统基因递送的主要衣壳。在我们早前发表的一篇论文中，介绍了AAV9穿越血脑屏障进入大脑的能力。但当我们研究这一点时，我们发现使用AAV这一方法还面临着免疫屏障等挑战。

因此，我们很快转向探索将病毒集中在神经系统周围的方法。简单的方法就是把病毒注射到脑脊液中。腰椎穿刺是一种常用操作。鞘内注射在人体很常见，但在小鼠并不常见，不过我们已经掌握了这项技术。对小鼠进行AAV9鞘内注射，在病毒体积限制和浓缩可达到的最大剂量，仍然会发现大脑中相当广泛的基因分布。

我想请大家注意几件事。首先，它可以扩散到不同的大脑结构中，我们可以更高效地靶向脊髓。但是如果你放大观察，你会看到神经元和神经胶质细胞的混合物，我们靶向的是这两种类型的细胞。

我们绝不是靶向每一个细胞，而是只靶向少数细胞。量化来说，在整个大脑中我们靶向了约10%的细胞。这是这项技术的局限性，每个使用这项技术的人都应该意识到，它离完美还差得很远，我们需要更好的载体。

尽管如此，我们还是做了相当多的工作，通过大量的基因递送研究，我们获益良多。我希望大家注意的另一件事是，即使我们是将病毒注射到脊髓液中，如果我们观察外周器官，仍然会发现有相当多的病毒逃逸到循环系统中，进入外周器官。

因此，经常有人问我，面对多系统疾病，我们应该进行AAV注射和鞘内注射吗？我说，即使是全部注射到脑脊液中，病毒依然会进入全身器官。

我们迅速地推进了这种方法。小鼠实验的结果非常好，我们在猪身上也进行了测试，并在2011年发表了第一篇论文，随后在一些非人类灵长类动物中进行了研究，并在十多年前发表了研究结果。当时刚好是SMA（脊髓性肌萎缩症）研究推进到AAV给药的那段时间，证实了其有效性。

我们也都看到了它的效果和优势：可以用更低的总剂量，还可以避免血液中的中和抗体。即便血液中有低水平的循环抗体，这些抗体也不会出现在脑脊液中。因此，我们给血清阳性动物和人类用药都是没有问题的。而且，与将百倍量的载体送到肝脏相比，通过这种给药途径，我们能够在大脑和外周器官中实现更均匀的载体分布。

为了更好地说明这一点，如果我们给非人灵长类动物体注射非常高的剂量，接近于人类的大约10^15vg（载体基因组），不是每公斤，而是总量，结果会与在小鼠中的分布非常相似。这是我们调查的22个不同的脑区的分布状况，可以看到每个细胞大约有0.1个vg。我们还发现，这些载体同样会出现在外周器官中，这与小鼠中的观察结果一致。实际上，如果将其与小鼠中的等效剂量进行比较，猴子和小鼠中的生物分布是十分相似的。

我们在小鼠、大鼠、猪、猫、狗、羊、非人灵长类动物，包括恒河猴和食蟹猴中都进行了这些实验。不仅仅是观察基因载体的拷贝数量，还要看载体的空间分布。在另一项非人灵长类动物研究中，我们仍然采用相当于人类1×10^15vg的高剂量，并使用RNA scope将转基因的表达可视化。我们使用的是一个非常弱的、最小的启动子。我们提取了猴子大脑中部的一部分，重点观察脑实质深部的区域，所有红色染色部分都是正在表达的转基因RNA。

这一结果再次验证了我们的设想，转基因虽然不是在每个细胞中都有表达，但是在整个大脑，甚至更深的脑结构中，都实现了相当均匀的分布。所以，这是一个通用的平台方法，可以应用于各种不同的疾病，这也正是我们实验室一直在做的。

Krabbe病的基因疗法效果

我们实验室的研究起始于2008年，最初是研究巨轴突神经病和Rett综合征，在研究这些疾病的过程中，我们开发了这个平台。在使用它治疗这些疾病时，我们意识到可以换上不同的基因，使用相同的载体、相同的剂量、相同的方法，来治疗其他疾病。

我不太擅长拒绝，所以会接受很多不同疾病的研究请求，这些年来我们也确实一直在研究这些疾病。到目前为止，这些项目中有一些已经进入临床试验。

第一个是巨轴突神经病，在2015年进入临床试验。这些是我们已成功治疗动物模型的疾病，并且正在努力将它们推进到临床试验。还有一些基因治疗项目处于早期开发阶段，也在努力推进。

接下来和大家分享两个故事，以便更好地说明基因递送的方法及潜力。其中最佳的应用是针对溶酶体贮积症，可以去分泌表达酶和交叉矫正来实现治疗。因此，如果我们将靶向基因分布到大脑中10%的细胞，这些细胞就可以成为制造酶的工厂，并将其扩散出去。

一个很好的实例是Krabbe病，也称球状细胞脑白质营养不良，这是一种常染色体隐性遗传病，可造成半乳糖脑苷酯酶缺乏。这是一种非常罕见的疾病，大约每20万名患者中有1例，也是一种非常严重的疾病，存在高度未满足需求。患儿的症状通常在约6个月时开始出现，并迅速恶化，通常在1~3岁时死亡。

我们在小鼠中进行了大量研究，幸运的是，我们找到了该疾病自然发病的狗模型，我们与美国宾夕法尼亚大学的研究人员合作，在狗模型中进行了基因治疗研究。患Krabbe病的狗必须在约4月龄时安乐死。

大家可以看到下面的生存曲线，其中包括未治疗的狗、仅接受免疫抑制治疗的狗，以及2周和6周龄接受基因疗法的狗。我们看到了一些疗效。红线代表的是治疗2周龄的，症状出现前用高剂量进行治疗，可以看到它的Kaplan-Meier曲线延长到约140周，超过两年，达到100%存活率。这项研究共有6只狗接受治疗。

大家可以看到，左侧是10周龄时注射了对照药物的狗，这些狗通常在约16周龄时因病去世。而右边这只狗是6只接受早期注射的狗之一，他们有相似的表型。在1岁半时没有出现临床症状，没有患病迹象。试验结束前他们已经4岁了。

对于Krabbe病，目前有一定效果的治疗方法是在出生后立即为婴儿进行骨髓移植。美国有大约10个州在进行该病的新生儿筛查，现在已经建议全部50个州开展该病新生儿筛查。我认为在出生时筛查出患者，在出生后立即进行基因治疗是可行的。

但这项工作尚未进入临床试验，需要继续推进，我们正在为此筹集资金。

利用基因治疗，使神经缓慢再生

我要介绍的另一种疾病是巨轴突神经病，也是我一切研究的起源。在会议二楼的影像展中就有这种疾病的患者。这是一种非常罕见的疾病，全球大约只有100名患者。这种疾病的研究是由一个非常有奉献精神的患者家庭推动的，他们非常擅长组织研究人员、协调工作以及筹集资金。

我们从2008年开始着手这项工作。这是一种进行性中枢神经和周围神经疾病。该病患者的轴突会退化，最初是从远端脚、脚踝开始受累，然后进展到手、手臂。最终，患者会失去移动双臂和双腿的能力，通常在20岁左右死于呼吸道感染。

这是一种单基因疾病。之所以叫做巨轴突神经病，是因为患者缺少一种叫做gigaxonin的蛋白。当缺少这个蛋白时，会累积中间丝。对周围神经进行活检，观察轴突时可以看到巨大膨胀的轴突，大量神经丝积聚。如果细胞能表达gigaxonin，就能清除和分解所有中间丝聚集，使细胞恢复正常、轴突重新生长。

2008年开始这项工作时，AAV9的特性还是未知，当时没有任何方法可以将一个基因广泛递送到整个大脑，我们一直在尝试突破。后来的三年，我们专注于AAV9的鞘内注射，并在动物模型和患者细胞中获得了概念验证数据。

2012年初，我们与FDA进行了沟通。当时我完全不知道什么是IND，也不知道将一种研究方法推到临床试验需要做什么。但我们坚持不懈，我所处的环境很好，能够接触到非常多优秀的导师，使我学会了毒理学研究、临床试验设计，监管机构的各类术语。

2015年，我们在美国国立卫生研究院（NIH）启动了1期临床试验。我们所有临床前的工作，几乎100%是由一家患者组织资助的，而这个组织是完全通过公众捐款做到的。2015年5月，九年前，迎来了我们的里程碑。我们在NIH治疗了首位患者，NIH承担了这项临床试验并提供了免费资源。这是一个非常好的平台，也是一次非常好的合作。

事实上，我们刚刚在《新英格兰医学杂志》上发表了这项研究的结果。我们通过运动功能评定32（MFM32）量表来评估疗效，它可以评估全身不同区域的肌肉功能。

约50名患者参与了自然病史研究，研究发现随着患者年龄的增长，运动功能稳步下降。我们将患者与自然病史中疾病进展情况进行比较，同时将患者与他们进入临床前评估结果进行比较。基本上，患者在进入试验前，与自然病史研究中的患者一致，呈下降趋势。而在治疗后，我们看到这种下降趋势减缓或稳定下来。尽管样本量较小，总共只招募了14名患者参与试验，但这个结果仍然意义重大。

我们还测量了患者的神经传导功能。在疾病进展的早期阶段，患者的周围神经传导功能会丧失，甚至无法检测到神经传导信号。在这两张观察感觉神经的图表中可以看到，虚线代表患者注射的时间点，在试验前神经传导功能下降，部分患者传导功能完全丧失，注射一年后疗效还不明显，但两年后有所改善，三年后进一步改善，四年后改善更加明显。这在疾病生物学上是很有意义的，如果我们矫正了神经元的胞体，就可以让神经缓慢再生，再生的速度约为每天一毫米。因此，神经再生需要数年时间。

这种神经传导功能的恢复在自然病程中是前所未有的。这项针对巨轴突神经病的临床试验是第一次通过脑脊液途径进行基因治疗给药。自那时起，我们已经进行了超过20项临床试验。红色标出的部分是我参与的，来自我实验室的研究。

去年，我们在《人类基因治疗》上发表了一篇综述文章，回顾了这些工作。

患者和家庭必须为他们的疾病发声

所以，将AAV9作为一个平台，无论是通过静脉注射还是鞘内注射，都是可行的。我认为鞘内注射有更多优势，目前已被多个实验室验证为一种有效的中枢神经系统疾病修饰基因治疗方法，并且在包括人类在内的多种物种中得到验证。尽管临床试验的数据还不多，但将来会越来越多。

我想强调的是，它只能靶向少数细胞。因此，除非是像Krabbe病这样通过交叉矫正治疗的情况，否则它只是一种潜在的有效治疗方法，我不会使用“治愈”这个词。

众所周知，AAV基因治疗仍然受限于一次给药，即使鞘内注射可以避免人体中已有的较低水平的抗体，但一旦注射，抗体水平就会变得非常高，这些抗体会出现在脑脊液中，导致无法再次给药。现在我们已经有了一些很好的技术，也有巨大的未被满足的需求。我们接下来要去向何方呢？

由Every Life Foundation发布的一项研究显示，2019年美国罕见病的经济负担达到约1万亿美元。所以，解决罕见病的问题不仅是人道主义需求，还有巨大经济影响。问题是，如何解决影响了8%人口的大约7000种罕见病呢？我们一次只能解决一种疾病，解决所有疾病需要很长时间。因此，我认为应当建立标准化的平台方法，使实验室可以更容易使用，整个团队可以更容易推进治疗，产生规模经济。

我非常高兴能够参与其中，P.J. Brooks昨天也提到了这个项目，即定制基因治疗联盟（Bespoke Gene Therapy Consortium，BGTC）。这是一个美国正在进行的项目，是一种公私联盟。它包括大型制药公司、NIH、FDA以及多个非营利组织。目标是创建一份如何开展此类工作的手册，开放获取，使每个人都能够更容易地开发此类治疗方法。

在被选择的八种疾病中，有三种来自我的实验室。SPG50已经进入临床试验，有多个患者接受了治疗，而另外两种疾病很快也会进入临床。现在我要谈一个哲学问题。我们正处在这样一个时代：患者们值得拥有更好的未来，并且我们拥有令人兴奋的基因治疗技术，但为什么这两者没有更多地结合起来？

我认为大多数情况下，因为患者数量太少，无法让制药公司感兴趣。我并不是要指责制药公司，商业公司必须考虑商业利益，这就是现实。所以，大多数的罕见病治疗，都是由患者家庭推动的。这是最不公平的局面，却是我们必须要面对的。患者和家庭必须为他们的疾病发声，学习科学知识，组织研究团体，筹集大量资金，同时还要时刻照顾自己特殊需求的孩子。

事实证明，虽然这不是一条最好的路，但它是一条可行的路。

总的来看，从患病到有效治疗这个过程的运作方式是，由私人基金会、政府、慈善机构资助初期的研究，然后将它交给市场，交给商业合作伙伴。但如果商业合作伙伴不感兴趣呢？为了使治疗方法研发顺利进行，必须要在前期投入资金。后期才能获得回报。这两者必须平衡。因此，我们要么降低成本，简化流程，加快进度，使其变的更容易，要么通过创造性激励措施使其具有商业价值。

我无法为大家提供解决方案，只能抛出这个问题。我认为另一个选择是为那些不符合传统盈利驱动药物开发范式的极罕见病建立某种政府支持项目或其他激励机制。我相信最终一定会解决这一问题。

最后，最让我兴奋的是不断涌现出的更好的AAV载体技术。这会解决很多问题，使这些治疗方法更有效，更容易，降低剂量，降低生产成本。

我要感谢我的团队，他们每天都在努力工作，对工作充满热情。同时感谢多年来帮助过我的各个资助方。谢谢大家。

校对 | 唐云哲

来源：永不落的红黑心