摘要：近年来，在原生质体或愈伤组织中应用DNA-free的CRISPR/Cas9技术能够有效地编辑植物基因组，该方法脱靶效率低，且无需引入外源DNA片段，这使得其在作物开发中备受青睐 (Chen et al., 2019)。碱基编辑器由Cas9核酸酶和腺嘌呤或胞嘧啶

近年来，在原生质体或愈伤组织中应用DNA-free的CRISPR/Cas9技术能够有效地编辑植物基因组，该方法脱靶效率低，且无需引入外源DNA片段，这使得其在作物开发中备受青睐 (Chen et al., 2019)。碱基编辑器由Cas9核酸酶和腺嘌呤或胞嘧啶脱氨酶组成，能够在目标位点进行精确的碱基替换 (A→G或C→T) (Anzalone et al., 2020)。碱基编辑技术已被用于小麦基因组编辑，使用无转基因的方法提高除草剂抗性 (Zhang et al., 2019)。

近日，JIPB发表了韩国全北国立大学Beum‐Chang Kang课题组题为“DNA‐free base editing in lettuce via in vitro transcribed base editors”的短文。研究团队开发了两种基于RNA的碱基编辑系统，在不引入外源DNA的情况下，实现了对生菜高效、精准的基因编辑。

研究人员开发了T7启动子驱动的腺嘌呤碱基编辑器 (ABE；TadA8e-nCas9(D10A)) 或胞嘧啶碱基编辑器 (CBE；hA3A-nCas9(D10A)-UGI)，并使用体外技术合成目标基因的sgRNAs，通过PEG介导的转染方法，将碱基编辑器RNA (ABE或CBE的mRNA和sgRNA) 转入生菜原生质体，通过靶向深度测序分析在原生质体、愈伤组织、芽体和植物中的编辑效率 (图1A)。

团队首先以生菜开花基因LsFT为靶基因，检测了无DNA的ABE系统的编辑效率。ABE‐sgRNA在LsFT基因中诱导了腺嘌呤到鸟嘌呤的转换，在生菜原生质体中的编辑效率高达6.24%。在愈伤组织中，这一转换的频率在0.65%到37.6%之间，而在芽体中则为0.50%到50.0%。在长日照条件下，ABE‐sgRNA碱基编辑的生菜相较于对照组表现出晚花表型，表明编辑在再生过程中得到了保持 (图1B–E)。

接下来，团队检测了CBE对靶基因生菜乙酰乳酸合成酶 (LsALS) 的编辑。LsALS是分支链氨基酸生物合成中的关键酶，其氨基酸突变 (P184F) 导致磺酰脲类 (SU) 除草剂抗性 (Zhang et al., 2019)。靶向深度测序结果显示，CBE‐sgRNA在生菜原生质体以高达12.6%的效率诱导了胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换。对照组的愈伤组织在除草剂处理后死亡，而CBE‐sgRNA处理组保持绿色并生成芽体，表明CBE通过编辑靶基因赋予植物除草剂抗性 (图1F–J)。

图1. 一种高效的基于RNA的腺嘌呤 (ABE) 和胞嘧啶碱基编辑 (CBE) 系统在生菜中的应用

综上，该研究建立了一个有效的基于RNA的腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑系统，在生菜的育种中发挥重要作用。该系统提供了一种安全、精确且高效的基因组编辑策略，在提高作物抗性和改良性状方面具有广泛的应用前景。

韩国全北国立大学Beum‐Chang Kang老师为文章通讯作者，Eunbin Lee和Yunsun Kim为共同第一作者，同单位Minju Kim和Donghui Lee参与了该研究。

参考文献：

Anzalone, A.V., Koblan, L.W., and Liu, D.R.(2020). Genome editing with CRISPR‐Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat. Biotechnol. 38: 824–844.

Chen, K.L., Wang, Y.P., Zhang, R., Zhang, H.W., and Gao, C. (2019). CRISPR/Cas genome editing and precision plant breeding in agriculture. Annu. Rev. Plant. Biol. 70: 667–697.

Zhang, R., Liu, J., Chai, Z., Chen, S., Bai, Y., Zong, Y., Chen, K., Li, J., Jiang, L., and Gao, C. (2019). Generation of herbicide tolerance traits and anewselectable marker in wheat using base editing. Nat. Plants 5: 480–485.

文章引用：

Lee, E., Kim, Y., Kim, M., Lee, D. and Kang, B.-C.(2024). DNA-free base editing in lettuce via in vitrotranscribed base editors. J. Integr. Plant Biol. https://doi.org/10.1111/jipb.13822

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来源：老赵讲科学