摘要：近年来，环肽因其卓越的高亲和性、优异的代谢稳定性及其在靶向“难成药”靶点方面的独特优势，逐渐成为药物研发领域的研究热点。噬菌体展示技术作为一种高效、便捷的筛选平台，已被广泛应用于肽类候选分子的发现。然而，如何在噬菌体展示平台上实现高效的环肽文库构建与功能筛选，

近年来，环肽因其卓越的高亲和性、优异的代谢稳定性及其在靶向“难成药”靶点方面的独特优势，逐渐成为药物研发领域的研究热点。噬菌体展示技术作为一种高效、便捷的筛选平台，已被广泛应用于肽类候选分子的发现。然而，如何在噬菌体展示平台上实现高效的环肽文库构建与功能筛选，仍然面临着显著的挑战。为克服这一瓶颈，亟需发展一种反应操作简便、生物相容性良好、底物适用性广泛且能够提供精确位点选择性的环化策略，以推动环肽药物的高效发现与应用。

兰州大学天然产物化学全国重点实验室雷新响教授课题组近年来致力于针对潜在药用靶点发掘活性环肽的研究，并在噬菌体展示多肽筛选领域开展了相关探索，成功地将化学成环策略（以邻苯二甲醛与异硫氰酸酯为主导）及酶催化成环策略应用于噬菌体展示平台上（New. J. Chem. 2022, 46, 10299; Chem. Sci. 2024, 15, 11847; ChemRxiv. 2024, DOI: 10.26434/chemrxiv-2024 zh6t7; J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 35090）。近日，该团队首次报道了将巯基-烯烃光点击化学策略应用于多肽的双环化、噬菌体展示双环肽文库的构建和疾病靶标活性环肽的筛选中（Angew. Chem. Int. Ed. 2025, 64, e202518628）。这一创新性方法为多肽双环化和环肽药物的发现提供了全新的思路，拓展了环肽药物研发的技术手段。

传统的双环肽构建方法，如TBMB、TBAB和TATA，常因与亲核性残基发生竞争性副反应，导致反应效率下降、色谱分离困难，且在生物环境中的兼容性有限。基于铋(III)的策略因其通过选择性配位与三个半胱氨酸残基结合来提高肽的稳定性和结合亲和力而受到关注，但仍依赖外部金属盐，并且配位键的动力学不稳定性在复杂环境中可能面临一定挑战。巯基–烯烃光点击化学（Thiol-Ene Photoclick Chemistry）策略结合了点击化学的核心优点——快速、高效和操作简便，同时具备光激活的独特特性，能够精确调控反应的空间和时间。这些独到的特性使其在双环肽、噬菌体展示双环肽文库的构建和疾病靶标活性环肽筛选中发挥了关键作用。

作者首先利用TAIC和N-乙酰基-L-半胱氨酸酯作为模型底物，通过一系列条件优化，确定了最佳反应条件，并将其拓展到线性多肽的双环化上。该反应能够在不同pH条件及不同缓冲盐溶液中有效进行，与传统的TBMB环化方法相比，巯基–烯烃光点击化学的环化策略更为高效，仅产生少量由连接子及光引发剂引起的杂质。此外，作者还将此策略拓展至一系列无保护的线性多肽肽链，验证了该环化策略在简便性和稳健性方面的优越性。

随后，作者将这一方法应用于噬菌体展示相关实验中。首先，通过MALDI-TOF MS验证了在表达的融合pIII蛋白上进行的环化反应的可靠性。接着，构建了一个包含十个随机氨基酸（CX5CX5C）的噬菌体展示线性肽文库，并利用巯基–烯烃光点击化学进行了环化。针对疾病相关靶标蛋白CypA，作者进行了多轮淘洗，最终通过二代测序得到了富集的多肽序列。随后，利用表面等离子共振（SPR）和生物膜层干涉（BLI）技术，对富集的两条线性多肽及其环肽的亲和力进行了测定。结果表明，环肽CM1相比线肽M1，具有显著提高的结合亲和力，达到364 ± 70 nM，并且展现了较好的稳定性，半衰期为463分钟。为了进一步探究CM1与CypA的相互作用，作者使用了15N标记的CypA进行1H-15N-HSQC NMR滴定实验，结果显示CM1结合于CypA的活性口袋。这些结果突出了巯基–烯烃光点击化学构建的双环肽在高效且选择性靶向治疗相关蛋白方面的潜力。

本研究首次报道了光化学策略应用于自由肽和噬菌体展示无保护肽的双环化。与传统的TBMB介导的烷基化方法相比，巯基–烯烃光点击化学方法在效率、选择性和控制性方面具有显著优势，同时能最小化筛选过程中的假阳性。该方法操作简便、可扩展，并且与生物系统兼容，使其成为生成多样化肽库和发现挑战性蛋白靶标及蛋白–蛋白相互作用（PPIs）配体的有力平台。总体而言，本研究突显了巯基–烯烃光点击化学在扩展多肽药物化学生物学工具箱方面的巨大潜力。

相关工作发表在Angewandte Chemie International Edition（DOI: 10.1002/anie.202518628）上，兰州大学天然产物化学全国重点实验室2023级博士研究生明巍、杨小琴为本文共同第一作者，雷新响教授为本文通讯作者。上述研究工作得到了甘肃省科技重大专项、甘肃省研究生创新之星项目的资助。

编辑：魏欣茹

责任编辑：彭倩

来源：兰州大学一点号