摘要：文章提出了一种名为双平面并行检测强度传输衍射层析成像(BP-TIDT)的新型高速高分辨率三维显微技术，用于量化无标记透明样品的折射率(RI)分布。该方法将双平面检测方案(BP)与传输强度衍射断层扫描(TIDT)相结合，有效地规避了高数值孔径(NA)物镜下对匹配
文章提出了一种名为双平面并行检测强度传输衍射层析成像(BP-TIDT)的新型高速高分辨率三维显微技术，用于量化无标记透明样品的折射率(RI)分布。该方法将双平面检测方案(BP)与传输强度衍射断层扫描(TIDT)相结合，有效地规避了高数值孔径(NA)物镜下对匹配照明条件的需求，实现了15 fps的体积速率和326 nm的横向分辨率。通过对聚苯乙烯微球和HepG2细胞的高分辨率成像，验证了该方法的有效性和准确性。此外，通过研究亚细胞器运动（包括线粒体和脂滴）以及活体COS-7细胞中的宏观凋亡过程，证明了BP-TIDT的广泛适用性。据目前所知，这是首次以非干涉和无运动的方式获得高时空分辨率的动态光学衍射断层扫描(ODT)结果，凸显了BP-TIDT在推进动态细胞过程研究方面的潜力。该项工作在LASER&PHOTONICS REVIEWS上以“High-Speed High-Resolution Transport of Intensity Diffraction Tomography with Bi-Plane Parallel Detection”为题发表。
ODT是一种新兴的3D显微镜技术，它利用透明生物样品固有的RI作为自然的对比机制，实现无标记成像。它能够以3D形式可视化并定量表征此类样品的内部结构。与传统的荧光成像方法不同，ODT无需外源荧光染料，从而避免了光毒性和光漂白等潜在问题。因此，这种非侵入性、无标记的方法已广泛应用于生物物理学、细胞生物学、血液学、微生物学和神经科学等各个领域，为研究人员提供了生物医学研究和临床应用的有力工具。
在过去的几十年里，研究人员结合全息摄影和计算机断层扫描的原理，开发了不同类型的ODT技术。这些相干ODT技术，无论是基于物体旋转还是照明扫描，都依赖于相干合成孔径来捕获必要的信息。基于非对称照明的非干涉ODT只需要利用样品和照明光束之间的相对角度变化来捕获不同条件下的2D强度图像。这些图像随后用于重建样品的3D RI。因此，它在高效、动态3D衍射断层扫描方面具有独特的优势。然而，传统的成像设备仅记录光的强度或振幅，导致丢失了编码透明样品结构和光学特性的宝贵相位信息。只有当照明的NA与物镜的数值孔径匹配时，二维相位传递函数(PTF)的两个反对称孔径才会相互位移和相切，从而允许低频相位信息通过非干涉测量准确地传递到强度图像中。这种现象也会影响ODT成像。
针对上述问题，作者之前的工作从不同的照明角度捕获了轴向强度叠加，将强度传输从“二维平面传输”扩展到“三维体积传输”。推导的三维成像传递函数理论表明，对数强度谱中的共轭项在三维傅里叶空间中始终可分离，从而消除了ODT成像中对照明条件匹配的要求。然而，该方法需要大量的z轴扫描，大大降低了其时间分辨率。Zhou等进一步将轴向离焦缩小为两幅图像，通过光强传输方程(TIE)方法恢复相位，直接补偿低频PTF。但该方法仍然存在两个缺点：1）低频填充仍然基于轴向采集，需要成像系统引入机械运动（移动两次）；2）仍然基于FPDT的迭代方法，需要多次迭代才能收敛。因此，TI-FPDT方法无法实现高速ODT成像，限制了其在生物样本（如活细胞）动态成像中的应用。迄今为止，在无标记非干涉ODT中获得高时空分辨率的动态3D RI重建是一项重大挑战。
为了在不影响速度或灵敏度的情况下实现轴向图像采集，研究人员提出了几种无需机械位移即可实现多平面检测的方法。Zhang等人将电调透镜集成到配备改进照明的传统显微镜中，实现了厚样本的实时、静止、高空间分辨率全焦成像。Gao等人采用一种光学配置进行并行两步相移数字全息显微镜(DHM)，并通过将两个相移全息图相互减去来抑制DC项，从而实现实时相位显微镜。Zuo等人使用类似于迈克尔逊结构的纯相位空间光调制器(SLM)模块实现了两个轴向平面的并行采集，然后将该方法与TIE方法相结合重建相位信息。该技术具有瞬时采集和自适应离焦距离调节的优势。但这些方法均应用于QPI成像领域，据作者所述，在ODT领域通过通道复用解决轴向采集问题尚未见报道。
在该项研究中，作者将前期工作融入到ODT方法中，以解决上述挑战。其原理有两方面：1）基于TI-FPDT概念，两幅散焦图像足以解决高NA条件下照明不匹配导致的低频传递函数缺失问题，因此只需进一步考虑双焦平面的并行检测。2）针对FPDT迭代计算耗时的问题，作者团队推导了一个双平面TIDT理论模型，通过一次反卷积直接求解线性问题，即可获得样品的3D RI结果。综上所述，提出了一种新的非干涉ODT系统，称为双平面并行检测强度传输衍射层析成像，用于高速、高分辨率的3D RI重建。基于商用显微镜平台构建了一套显微成像系统，结合LED照明控制和SLM孔径平面相位调制技术。采用高NA物镜(40×0.95 NA)和0.65 NA照明，成功实现了分辨率为326 nm的非干涉3D RI的高分辨率重建。使用聚苯乙烯微球的模拟和实验结果证明了其BP-TIDT方法在高NA条件下恢复低频成分的一致性和有效性。此外，研究通过高分辨率RI断层扫描和未染色的HepG2细胞的定量表征展示了BP-TIDT在生物样本成像方面的能力。最后，文章展示了体外COS-7细胞的高速15 fps动态延时3D成像。理论评估和实验结果均表明BP-TIDT有望成为一种有价值的3D成像工具，适用于生物医学和生命科学领域的一系列应用。
图1a展示了BP-TIDT系统的实验装置。该装置充分利用了非干涉检测的优势，能够直接与标准倒置显微镜（IX71，日本奥林巴斯）集成。LED光束穿过样品、物镜和镜筒镜头，在相机输出端口（图像平面）生成放大的样品图像。在显微镜图像平面的配置中，一对透镜，分别为L1和L2，焦距均为150 mm(f=f1=f2=150 mm)，形成远心4f光学系统。该系统采用非偏振分束立方体(BS)将入射光束分成两束不同的光束：一束反射光束和一束透射光束。这两束光束随后被引导至各自的傅里叶平面：即SLM和反射镜(M)。反射镜M和SLM倾斜，与光轴形成小角度，其中角度α≈2°，导致两束反射光束发生横向位移。因此，两束反射光束的横向偏移为±α。镜头移动时L2，角度错位2α被转换成沿着图像宽度方向的线性分离2f×sinα，有效地将图像分成两半。为了防止两幅图像重叠并优化相机传感器的有效面积，在显微镜成像平面后方巧妙地放置了一个矩形光圈，用于执行平面滤波。代表自由空间传递函数的二次相位图样被投射到SLM上，从而促进透射光束沿Δz轴。在SLM之前，安装了一个线性偏振器来提高相位调制效率，而一个中性密度滤光片确保在相机的左右两侧分布相同的平均强度（为清楚起见，图1中未显示这些组件）。ARM控制器协调环形LED和相机之间的同步。这是通过一对同轴电缆触发和监控曝光状态来实现的，这使得能够以120 Hz的速率从相机同时采集双平面强度数据集。随后，利用提出的BP-TIDT算法在高NA和不匹配的照明条件下重建样品的3D RI分布。
对于2D QPI和3D ODT中未标记的透明生物样本，相位分量Δφ是强度对比度的主要决定因素。图2a显示了无像差成像系统在不同照明配置下的二维PTF。可以观察到，一个聚焦最佳且采用轴向照明的成像系统无法产生相位衬度，这是由于两个不对称的光瞳相互抵消了彼此的影响，这也是难以观察到纯相位物体结构的原因。然而，随着照明角度增加，可以实现光瞳分离，防止光瞳完全重叠，并使非重叠区域的相位信息可见。然而，只有当照明角度与物镜的NA一致时，低频区域（接近零频率）的相位分量才能完全转移到强度图像中。图2b显示了焦平面上捕获的原始强度图像中低频相位分量缺失的现象，进一步验证了这个问题。在基于非对称照明的非干涉QPI方法中，匹配照明条件对于精确的相位恢复至关重要。然而，对于大数值孔径物镜来说，实现匹配照明是一项挑战。在3D断层成像中，重要的是要认识到焦平面和各种离焦平面之间的传统区别并不那么严格。这是因为在断层重建中，来自标称对焦平面和标称失焦平面的信息都会对整体3D图像产生影响。为方便表示，将样品的中心层指定为焦平面，并将其他所有平面视为离焦平面。因此，与双平面平行测量相对应的传递函数如图2c所示。
为了验证作者的BP-TIDT系统的定量三维折射率重建能力，研究使用聚苯乙烯微球作为测试样品进行了实验，并将结果与纯相微球的模拟结果进行了比较。实验和模拟重建均采用一致的参数进行，以确保比较分析的有效性。图2d的第一行分别显示了在仿真和实验过程中在不同焦平面捕获的强度图像。双平面平行检测和照明角度扫描的组合产生了24幅图像。由于最大0.65 NA照度小于40×0.95 NA物镜，传统IDT方法无法正确恢复微球的RI，只能重建锐利边缘（高频细节），如图2d第二行所示。这种现象与作者预测的由于光照条件不匹配会导致低频RI损失一致。通过双平面平行检测，在每个照明角度获取的额外散焦强度图像提供了低频相位对比，使得所提出的方法能够恢复微球的低频RI。如图2d第三行所示，实验结果与模拟结果差异难以区分，表明BP-TIDT技术无需额外的轴向机械位移即可有效实现定量RI恢复，克服了非匹配光照条件下传统IDT重建质量下降和RI低估的问题。
为了展示BP-TIDT的生物学应用，首先对未标记的HepG2细胞进行成像，并获得了高分辨率的RI断层扫描图像。图3a,b分别展示了40个不同亚区内不同区域RI的重建结果。使用BP-TIDT算法重建的视场(FOV)，并以IDT算法作为对照，对比了重建结果。图3c1–d2中矩形子区域对应的放大RI分布和核仁轮廓，突显了两种不同算法重建结果在低频成分上的差异。对比结果表明，BP-TIDT算法克服了光照条件不匹配导致的RI低估问题，能够准确恢复生物细胞的RI。图3e,f显示，两个感兴趣区域(ROI)在不同轴向深度的断层扫描图像展现出丝状延伸和其他亚细胞特征（包括细胞边界、核仁和暗囊泡）的高分辨率可视化。实验结果证实，由于照明条件不匹配，传统IDT方法在高数值孔径物镜下会丢失复杂生物样本中的低频信息。图3g,h中的剖面图验证了BP-TIDT方法在确保约328 nm的近衍射极限横向分辨率的同时，显著增强了重建RI中的低频信息，从而获得了更准确的细胞形态。
最后，作者应用提出的BP-TIDT方法对活体COS-7细胞进行无标记延时三维成像。测量活体样本时，选择了合适的照明方案和曝光时间以减少与运动相关的伪影。图4a展示了在z=0 µm低于40×0.95 NA物镜用于COS-7细胞。文章选择了三个ROI区域并放大这些区域，以突出不同深度的亚细胞细节和动态。图4b展示了从四个视角重建的COS-7细胞3D体渲染视图，直观地展示了样本的三维结构和分布。
综上所述，文章提出了一种新的BP-TIDT方法，并搭建了相应的ODT实验装置。该方法将双平面探测方案与传输强度衍射层析成像技术相结合，能够在不影响速度和分辨率的情况下，有效克服传统非干涉ODT在非匹配光照条件下重建质量下降和RI低估的问题。通过PTF分析，推导出了双平面TIDT理论模型，通过一次反卷积直接求解线性问题即可获得样品的三维RI结果，解决了传统迭代求解方法计算时间耗费的问题。此外，文章分析了BP-TIDT的离焦距离和光照方案对成像质量和速度的影响。对聚苯乙烯微球、HepG2和活体COS-7样品的重建结果表明，所提出的BP-TIDT能够实现15 fps的体积速率和326 nm的横向分辨率。据作者所述，这标志着首次在不使用干涉或运动方式的情况下实现高时空分辨率动态ODT结果。这一突破彰显了BP-TIDT作为一项领先的非侵入性技术在细胞和亚细胞尺度上探索生物现象结构和动力学的潜力。
尽管如此，仍有一些关键问题值得进一步探索或阐明。作者提出的BP-TIDT断层扫描方法通过散焦相位调制摆脱了对匹配照明的需求。然而，它的理论框架仍然依赖于一阶Rytov近似。该模型的有效性取决于样品内的RI，这可能会限制其在表现出多层或显着散射的样品中的使用。此外，由于入射光束角度范围受限，光轴上的某些空间频率分量无法实现，即缺失锥问题。这个问题不仅降低了轴向分辨率，而且妨碍了RI重建的精度，并可能在细胞成像的边缘引入光晕效应。在作者未来的工作中，可以通过结合之前提出的相反照明策略来缓解这个问题。或者，可以利用基于学习的3D断层扫描方法这一新兴领域，对缺失的视锥伪影和未知的实验变量（例如光学像差和LED的轻微错位）进行适当的参数化。该方法可以进一步优化成像性能。此外，为了获得更多的生物分子特异性，可以考虑将荧光超分辨率3D技术（例如共聚焦、3D-SIM）集成到BP-TIDT中。通过结合荧光方法的精确性和衍射断层扫描的非侵入性，可以更广泛、更深入地理解生物过程。这种协同作用为更全面地探索细胞和亚细胞动力学铺平了道路，有望显著推动生物成像领域的发展。
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