Nature | 解离速率可提升5700倍，设计“促解离”蛋白系统实现细胞因子信号的秒级操控

摘要：在蛋白质设计领域，过去的研究主要聚焦于设计稳定的蛋白质基态结构，确保其在生理条件下的高度稳定性和高亲和力【1】。然而，蛋白质相互作用的动力学控制（尤其是如何实现快速结合与解离）一直是一个挑战。自然界中存在一些促进解离的系统，即通过第三个分子（效应子）的结合，加

撰文|亦

在蛋白质设计领域，过去的研究主要聚焦于设计稳定的蛋白质基态结构，确保其在生理条件下的高度稳定性和高亲和力【1】。然而，蛋白质相互作用的动力学控制（尤其是如何实现快速结合与解离）一直是一个挑战。自然界中存在一些促进解离的系统，即通过第三个分子（效应子）的结合，加速目标蛋白从复合物中解离，从而实现高亲和力与快速交换并存【2，3】。例如，工程化DNA系统中的“链置换”机制已被广泛应用【4，5】，但在蛋白质系统中，缺乏一种通用设计方法来实现类似的动力学控制。

近日，来自华盛顿大学蛋白质设计研究所的David Baker、Florian Praetorius和Adam J. Broerman合作，共同在Nature上发表了题为Design of facilitated dissociation enables timing of cytokine signalling的文章。成功设计出一类新型蛋白质系统，能够通过效应子诱导的构象变化，实现促进解离，并将目标蛋白的解离速率可提升 5700倍。

作者的设计思路是将一种构象开关蛋白与目标结合蛋白融合，使得在效应子未结合时，目标蛋白可以正常结合；而在效应子结合后，开关蛋白发生构象变化，与目标蛋白发生空间冲突，形成高能三元复合物，从而加速目标蛋白的解离（见下图d，e）。关键在于，这个三元复合物中间体的能量既不能太高（否则促进解离路径不会更快），也不能太低（否则靶标不会解离）。为了将三元复合物中间体的能量设定在此最佳范围内，作者推断可以通过改变开关-结合体融合的几何结构来控制三元复合物中的应变水平。首先利用一种先前设计的效应子响应型构象开关【6】，该开关能够通过刚性铰链运动从闭合状态（X）转变为开放状态（Y），且在开放状态Y下能以极高亲和力结合效应子肽。对于模型结合体-靶标相互作用体系，作者选择了经过设计的异源二聚体对【7】，该体系的解离速率足够缓慢，能够允许准确测量效应子诱导的靶标解离显著加速现象，同时又未慢于效应子自身的解离速率，从而确保靶标比效应子更易从三元复合物中解离。

作者合成了编码12种设计的基因，并对蛋白质进行表达纯化，发现其中最优设计（AS0）在靶标存在时表现出缓慢且减弱的效应子结合。由于开放状态Y会与目标蛋白发生空间冲突，当目标蛋白结合时，这种构象变化过程十分缓慢，从而限制了效应子的结合速率以及促进解离的整体速率。若效应子能够先与状态X结合，并加速其向状态Y的转变，便可绕过这一缓慢步骤。于是作者从AS0出发，通过引入相对于状态Y的最小旋转，在状态X下保持裂隙的开放状态，并通过最小化两个状态间的局部结构差异，构建了新的状态X。作者获得了编码10种此类设计的合成基因，重点关注效应子结合最紧密的设计（ AS1 ）。为进一步分析三元复合物的形成机制，作者使用2种不同的效应子（一种多肽和3hb）对促进解离过程进行表征，发现这2种效应子与AS1的相互作用几乎完全相同。刚性的3hb只能结合到AS1的完全开放状态Y，并且THX → THY的构象变化速度较慢，而与3hb相反，多肽效应子的结合及其导致的目标蛋白去稳定化都能比THX → THY构象变化发生得更快，这表明更灵活的多肽效应子能够结合到处于状态X的AS1，并通过诱导拟合机制来加速这一构象变化。X射线晶体学的结构表征、双电子-电子共振光谱和分子动力学模拟都表明，三元复合物是动态的，每个位置的应变程度各不相同。

那么如何最大化目标蛋白的解离速率加速效果呢？作者制定了2个策略： 1）降低基础解离速率，使没有效应子时，目标蛋白与宿主结合得更稳定。2）提高促进解离的速率：增加三元复合物的应变能，使目标蛋白从中解离得更快。他们以AS1为起点，通过改变靶标-结合子模块相对于开关的位置，构建了一系列变体，并利用AlphaFold2预测了这些变体在三元复合物中的变形方向和程度，并筛选出具有不同应变模式的设计。在此过程中，作者发现应变能的调控取决于变形的幅度和方向。最终鉴定出最优变体AS117在效应子存在时，目标蛋白解离速率提升了2,400倍，且绝对速率超过了AS1。

接下来，作者利用“促进解离”这一机制来构建具有新型动力学行为的蛋白质系统。如借鉴DNA技术中的“链置换”反应，在加入原始效应子后，它通过促进解离迅速释放E2-靶标，后者随即激活H2，触发一个快速的链式反应。将AS1和其靶标分别与拆分荧光素酶片段融合。当它们结合时，产生荧光信号，实现快速关闭的拆分酶系统。将拆分荧光素酶的小片段“囚禁”在结合了宿主的效应子中。当靶标结合时，通过反向促进解离机制迅速释放该片段，使其与另一个片段快速重构酶活性，实现快速生物传感器。

最后，作者成功设计了一个可快速开关的IL-2模拟蛋白，能够以秒级精度控制免疫信号通路的持续时间。他们将一个名为Neo2的IL-2模拟蛋白与构象开关融合，设计了ASNeo2。在其状态X下，它能正常结合IL-2受体并激活信号；在效应子结合的状态Y下，则会与受体发生强烈冲突。体外与细胞实验显示，效应子可将受体γc的解离速率最高提升5,700倍（所有设计中的最高记录），不仅能快速关闭细胞表面二聚化，还能快速终止信号传导。进一步地，在原发性人类T细胞中，通过ASNeo2进行瞬时刺激与持续刺激，发现了截然不同的细胞反应：短暂刺激（5-25分钟）足以提供抗凋亡保护，并上调抗凋亡和免疫激活相关基因，但不足以驱动细胞增殖，而持续刺激才能激活与细胞周期进程和代谢重编程相关的基因程序。

综上所述，文章首次提出并验证了一种通用策略，用于设计具有可控解离动力学的蛋白质系统。通过引入激发态，设计出了效应子诱导的解离速率提升高达5,700倍的系统。该设计揭示了IL-2信号持续时间对不同下游通路的差异性调控，为理解细胞信号“时间编码”提供了新工具。同时可用于构建快速生物传感器、动力学调控的蛋白质电路、时间可控的细胞信号操控系统。

制版人：十一

参考文献

1. Huang, P.-S., Boyken, S. E. & Baker, D. The coming of age of de novo protein design.Nature537, 320–327 (2016) .

2. Pennington, L. F. et al. Directed evolution of and structural insights into antibody-mediated disruption of a stable receptor-ligand complex.Nat. Commun.12, 7069 (2021) .

3. Åberg, C., Duderstadt, K. E. & van Oijen, A. M. Stability versus exchange: a paradox in DNA replication.Nucleic Acids Res.44, 4846–4854 (2016).

4. Zhang, D. Y. & Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.Nat. Chem. 3, 103–113 (2011).

5. Sarraf, N., Rodriguez, K. R. & Qian, L. Modular reconfiguration of DNA origami assemblies using tile displacement.Sci. Robot.8, eadf1511 (2023).

6. Praetorius, F. et al. Design of stimulus-responsive two-state hinge proteins.Science381, 754–760 (2023).

7. Sahtoe, D. D. et al. Reconfigurable asymmetric protein assemblies through implicit negative design.Science375, eabj7662 (2022) .

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