摘要：细胞外囊泡是由细胞分泌的脂质双层层膜囊泡，在细胞间通讯中扮演关键角色，并具有广泛的生物医学应用潜力，如疾病诊断、药物递送等。然而，传统的细胞外囊泡分离方法（如超速离心）通常需要复杂的预处理步骤，耗时耗力且难以实现大规模分离，限制了其临床与工业化应用。当前的技术

新型中-大孔水凝胶实现细胞外囊泡的直接升规模分离与应用

细胞外囊泡是由细胞分泌的脂质双层层膜囊泡，在细胞间通讯中扮演关键角色，并具有广泛的生物医学应用潜力，如疾病诊断、药物递送等。然而，传统的细胞外囊泡分离方法（如超速离心）通常需要复杂的预处理步骤，耗时耗力且难以实现大规模分离，限制了其临床与工业化应用。当前的技术在效率、可扩展性、可及性和可定制性方面均存在不足，亟需一种更简便高效的分离策略。

近日，韩国科学技术院脑科学研究所Nakwon Choi、Ji Yoon Kang和高丽大学Ki Wan Bong合作，提出了一种基于中-大孔水凝胶的直接细胞外囊泡分离技术，无需预处理即可从多种生物体液（如全血、唾液、尿液、牛奶等）中高效分离细胞外囊泡，并支持升规模操作。该水凝胶具有约400纳米的孔径，通过表面电荷选择性捕获囊泡，并利用高离子强度实现高效回收，同时还可作为固相载体长期保存细胞外囊泡，便于后续分析。相关论文以“Meso–macroporous hydrogel for direct litre-scale isolation of extracellular vesicles”为题，发表在nature nanotechnology上。

研究团队采用聚乙烯醇二丙烯酸酯（PEGDA）为材料，通过低温光交联技术制备出具有中-大孔结构的水凝胶颗粒。荧光示踪实验表明，该水凝胶允许最大200纳米的颗粒扩散，而450纳米的颗粒则无法进入，验证了其孔径控制的精确性（图1c）。研究人员还展示了批量制备水凝胶颗粒的能力，每批次可同时制作121个颗粒，为规模化应用奠定基础（图1d）。

图1 | 基于水凝胶的直接细胞外囊泡分离概述及中-大孔水凝胶颗粒的制备与孔隙表征 a. 示意图展示使用中-大孔水凝胶从多种生物体液中直接分离细胞外囊泡及其在诊断、预后、治疗和化妆品等领域的广泛应用，包括升规模分离和在水凝胶内保存细胞外囊泡。 b. 显示通过低温光交联工艺制备中-大孔PEG700DA颗粒的示意图。DI，去离子水。 c. 中-大孔（上图）和微孔（下图）颗粒在1小时内的各种荧光指示剂一维径向扩散荧光图像：荧光素（约1纳米）、FITC标记的10 kDa葡聚糖（4.72纳米）、绿色荧光二氧化硅纳米珠（100和200纳米）和FITC-二氧化硅纳米珠（450纳米）。强度标尺对各指示剂相同。 d. 显示中-大孔水凝胶颗粒的11×11阵列快照（左图）和用于储存的冻干中-大孔颗粒在玻璃瓶中的照片（右图）。 a图使用BioRender.com创建。

细胞外囊泡的分离过程分为三个步骤：凝胶内捕获、洗涤和凝胶外回收（图2a）。扫描电镜和透射电镜图像清晰展示了水凝胶在捕获细胞外囊泡前后的结构变化，以及最终成功回收的囊泡形态（图2a(i)–(iii)）。与微孔水凝胶相比，中-大孔水凝胶的细胞外囊泡产量提高了约28倍，且蛋白浓度可检测（图2b）。其捕获机制源于PEG链在高盐环境下诱导囊泡聚集并选择性吸附（图2c），而低温透射电镜进一步确认了回收囊泡具有典型的脂质双层结构（图2d）。

图2 | 基于中-大孔水凝胶的直接细胞外囊泡分离流程及基本原理 a. 显示使用中-大孔水凝胶颗粒进行细胞外囊泡分离流程的示意图：一体管分离（粉色阴影框）或可换管分离（绿色阴影框）。标签1、2、3代表在流程各步骤中将样品连续转移至新管。每个SEM图像代表中-大孔颗粒在细胞外囊泡分离前（i）、细胞外囊泡凝胶内捕获后（ii）或细胞外囊泡凝胶外回收后（iii）的横截面。 b. 使用中-大孔（蓝色）和微孔（灰色）水凝胶颗粒获得的细胞外囊泡产量和蛋白浓度。 c. 示意图描绘由水凝胶的中-大孔和盐（NaCl）介导的细胞外囊泡主动凝胶内捕获的基本原理，从而实现了对可渗透但被排斥的杂质（

研究团队成功将该方法扩展至升规模操作，从1升胃癌患者腹水及1升牛奶中高效分离出细胞外囊泡（图3a–e）。腹水来源的囊泡表达典型的细胞外囊泡标志物（如CD63、ALIX）及肿瘤转移相关蛋白（如N-钙黏蛋白、闭锁蛋白-1），显示了其在癌症诊断中的潜力（图3b）。牛奶细胞外囊泡的分离量随样本体积增大而显著提升，且纯度与粒径分布保持一致（图3d,e）。

图3 | 使用中-大孔水凝胶颗粒进行升规模直接细胞外囊泡分离 a, e. 通过水凝胶分离的胃癌患者腹水细胞外囊泡（a）和牛奶细胞外囊泡（e）的粒径分布、产量和纯度。 b. 蛋白质印迹图像显示胃癌患者腹水细胞外囊泡中细胞外囊泡阳性（CD63和PDCD6IP）和肿瘤转移（CDH2、CLDN1和ANG）标志物的表达。 c. 显示冻干水凝胶颗粒（左图）在玻璃瓶中以及倒入1升牛奶后的瓶子照片（右图）。 d. 从1升（紫色）和1毫升（蓝色）牛奶中分离出的细胞外囊泡数量。 f图使用BioRender.com创建。

该中-大孔水凝胶还表现出优异的稳定性和可重复使用性。即便经过脱水-再水循环或加速老化处理（相当于室温储存1年），其结构完整性及细胞外囊泡捕获能力仍保持不变（图4a,b）。更重要的是，水凝胶可作为细胞外囊泡的保存载体，冻干后在室温下储存32天仍能保持较高回收率，60天内仅下降约20%（图4c–e），远优于传统冷冻保存方式。

图4 | 中-大孔水凝胶作为细胞外囊泡保存载体 a. 中-大孔水凝胶颗粒在湿润（左）、脱水（中）和再水合（右）状态下的照片。白色虚线圆圈表示脱水前湿润状态的颗粒大小。 b. 使用老化状态（红色；相当于1年的加速老化）、脱水后再水合状态（黄色）和湿润状态（蓝色）的中-大孔颗粒分离的细胞外囊泡产量。 c. 示意图显示从在室温下储存后的冻干细胞外囊泡捕获的中-大孔水凝胶颗粒中分离细胞外囊泡的流程。 d. 立即回收（对照，蓝色）和从冻干细胞外囊泡捕获的水凝胶颗粒储存5天后回收（红色）的细胞外囊泡的粒径分布和纯度。 e. 冻干后随时间推移，分离细胞外囊泡的相对产量（产量除以第0天的产量）。

该技术具备高度可定制性：用户可通过调整回收体积实现细胞外囊泡的浓缩（图5a），或使用更小的水凝胶颗粒在15分钟内完成快速分离（图5b,c）。通过调控冷冻温度，还可选择性捕获不同大小的细胞外囊泡亚群（图5d,e）。尤为突出的是，该技术可直接从全血中分离细胞外囊泡，无需预先去除血细胞，相比超速离心具有更高效率和更短时间（图5f,g）。在唾液和干细胞培养基等低浓度或高黏度样本中，该方法同样表现优异（扩展数据图9）。

图5 | 基于水凝胶的细胞外囊泡分离的可定制性与通用性 a. 通过改变凝胶外回收体积获得的细胞外囊泡产量（蓝色）和数量（灰色）。 b, c. 使用10微升水凝胶颗粒通过改变凝胶外回收体积（b）以及改变分离时间（c）分离的细胞外囊泡数量、粒径分布、产量和纯度。 d. 通过改变水凝胶前体溶液低温光交联期间的冷冻温度获得的细胞外囊泡粒径。 e. 使用在-80°C（蓝色）和-195°C（红色）冷冻条件下制备的水凝胶颗粒分离的细胞外囊泡的粒径分布、产量和纯度。 f. 比较示意图描述了从人全血中分离细胞外囊泡的流程及时间线。 g. 通过水凝胶（蓝色）和超速离心（灰色）分离的全血细胞外囊泡的粒径分布、产量和纯度。 f图使用BioRender.com创建。

在下游应用方面，研究团队验证了牛奶细胞外囊泡在促进人皮肤成纤维细胞和角质细胞增殖、抗氧化及胶原表达方面的功能（图6a–g），展示了其在化妆品和治疗领域的潜力。此外，通过尿液细胞外囊泡的miRNA分析，成功区分了前列腺癌患者与健康对照（图6h,i），体现了其在无创诊断中的应用前景。

图6 | 治疗与诊断的下游分析 a. 比较示意图描述了从牛奶中分离细胞外囊泡的流程及时间线。 b. 通过水凝胶（蓝色）和超速离心（灰色）分离的牛奶细胞外囊泡的粒径分布、产量和纯度。 c, d. 在体外培养第3天，使用相同牛奶体积（c）和相等颗粒数量（d）分析处理24小时后，经水凝胶（蓝色）和超速离心（灰色）分离的牛奶细胞外囊泡对人皮肤成纤维细胞增殖的影响（相对于无牛奶细胞外囊泡处理（白色））。 e. 荧光图像显示在相等颗粒数量分析中，人皮肤成纤维细胞的细胞核（蓝色）和II型胶原（绿色）表达，取决于处理方式：水凝胶分离（左）、超速离心分离（中）和无处理（右）。 f. 在相等颗粒数量分析中，处理24小时后第3天人类角质形成细胞的增殖情况。 g. 蛋白质印迹图像显示在相等颗粒数量分析中，人类角质形成细胞的谷胱甘肽化蛋白和GAPDH蛋白表达。 h. 通过水凝胶（蓝色）和超速离心（灰色）分离的人尿液细胞外囊泡的粒径分布和纯度。 i. 尿液细胞外囊泡miRNA分析作为诊断下游分析的示意图，以及显示12名健康对照和12名前列腺癌患者的比率荧光信号（miR-6090强度除以miR-3665强度）的SuperPlot图。 a, i图使用BioRender.com创建。

综上所述，该研究开发的中-大孔水凝胶技术为细胞外囊泡的分离、保存与下游应用提供了高效、可扩展且灵活的解决方案，突破了传统方法在预处理、通量和稳定性方面的限制。未来，该技术有望推动细胞外囊泡在疾病诊断、药物递送和再生医学等领域的工业化进程，并为实现基于水凝胶的连续化、自动化分离系统奠定基础。

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来源：邓天晴